为修复人类DNA损伤贡献重要认识：科学家发现DNA依赖性 ...

Abraham30

2022 年新年刚过，复旦校友、剑桥大学生物系博士梁世康的Nature一作论文上线没多久，他就把另一篇姊妹篇论文的初稿交给导师，如今这篇论文也已被Nature子刊收录。

连续两篇论文都被Nature系期刊收录，除了自身的努力之外，也让梁世康和导师不禁感慨：同样是研究 DNA 损伤修复蛋白复合物结构，有了冷冻电镜之后的研究速度和晶体时代简直不可同日而语。



图 | 梁世康（来源：梁世康）

在 2023 年这篇论文中，梁世康揭示了 DNA 依赖性蛋白激酶（DNA-Dependent Protein Kinase, DNA-PK）激活的详细分子机制，并在激活催化过程中发现了重要的蛋白质结构域。

结合之前的研究 [1]，让他得以详细了解从 DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基、到 DNA 依赖性蛋白激酶全酶复合物的激活分子机理，为人类 DNA 损伤修复和 DNA 断裂修复增添了重要的分子机理认识。

相关论文揭示了作为超大型非典型激酶的 DNA 依赖性蛋白激酶复合物，在激活过程中的具体分子机理。

这让人们能够了解不同的蛋白结构域尤其是灵活结构域，在激活过程中的变化与作用。



（来源：Nature Structural & Molecular Biology）

据介绍，DNA 依赖性蛋白激酶是延缓和治疗癌症的重要靶点。抑制 DNA 依赖性蛋白激酶的活性，可以增强癌细胞的 DNA 损伤累积，还能促进传统的放疗和化疗的效果。

因此，针对 DNA 依赖性蛋白激酶的特异性抑制剂，在癌症治疗领域有着巨大潜力。然而，由于目前针对激酶的药物分子库的限制和之前有限的结构认识，所有已开发的 DNA 依赖性蛋白激酶抑制剂，都是针对天然配体结合位点，很容易催生肿瘤的抗药性。

而现在，在了解 DNA 依赖性蛋白激酶复合物催化激活的详细分子机理后，除了已经开发的激酶竞争性抑制剂之外，还可以针对其他特异性较高的位点设计变构抑制剂，做出针对 DNA 依赖性蛋白激酶的高特异性抑制剂，同时还能降低肿瘤突变产生的的抗药性。



（来源：Nature Structural & Molecular Biology）


成功分离中间态和激活态

很多人都知道，DNA 是人类遗传信息的主要载体，它可以指导细胞维持正常生理功能。对于细胞的正常工作和人类稳定的繁衍传承来说，保证 DNA 和基因组稳定至关重要。

然而，由于一系列内部和外部影响因素，比如氧化产生的自由基、紫外线、电离辐射、化学污染等，DNA 的损伤是不可避免的。

人体内有一套极其复杂的 DNA 损伤修复机制来应对这些损伤，因此研究相关的机理有着重要的生物学意义。

同时，对于认识癌症的发展和相关治疗来说，研究 DNA 损伤修复机制也有着重要的医学意义。原因在于，癌症的标志之一便是基因组的不稳定和不完整的 DNA 损伤机制。传统的放疗/化疗和新的合成致死疗法，都是通过破坏癌细胞的基因组稳定，来达到杀死癌细胞目的进而治疗癌症。

在人类复杂的 DNA 损伤修复系统中，DNA 依赖性蛋白激酶起着控制信号传导、以及促进 DNA 断裂修复的核心作用。

DNA 依赖性蛋白激酶的出现和命名始于 20 世纪 90 年代初。当时，人们发现往细胞裂解物中添加双链 DNA，能够促进某些蛋白的磷酸化。随后，学界进一步发现 DNA 依赖性蛋白激酶全酶，包含 DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基和 Ku70/80 异二聚体。

从晶体时代到冷冻电镜技术革命爆发以来，包括英国皇家学会院士、剑桥大学生物系教授托马斯·布伦德尔（Thomas Blundell）课题组在内的不同团队，都对 DNA 依赖性蛋白激酶相关的蛋白和复合物有着新的认识。

然而，对于 DNA 依赖性蛋白激酶全酶活化过程的具体分子机理和结构变化，人们依旧不够明晰。

而在本次研究中，目前在Thomas Blundell 课题组做博后研究的梁世康，通过激酶抑制剂来稳定蛋白激酶复合物和冷冻电镜单颗粒，借此成功分离出激酶复合物的中间态和激活态两种构象。

通过对比中间态与激活态的结构，可以了解具体的分子激活机理，揭示与激酶催化中心相隔“百里”的 DNA 末端到底是如何传导激活信号的，以及小分子配体起到的作用。



（来源：Nature Structural & Molecular Biology）


“导师免了我的后顾之忧”

在本次研究之前，梁世康已经比较熟悉激酶激活机理研究模式、以及 DNA 依赖性蛋白激酶的相关知识。

因此对于课题计划，他打算分为两步走：1）优化实验设计和条件，了解 DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基与配体相互作用的结构；2）进一步研究全酶复合物与配体互相作用和催化机理。



（来源：Nature Structural & Molecular Biology）

在自然状态下，结合天然配体和底物的激活态激酶，一般非常不稳定且难以捕捉。不仅如此，DNA 依赖性蛋白激酶还存在其他挑战：比如复合物结构庞大且灵活度高，并拥有大量的无结构蛋白序列。

为了得到稳定的、不同形态的 DNA 依赖性蛋白激酶，研究激酶全酶与抑制剂复合物的结构，将是一个不错的办法。

通过模拟天然配体，抑制剂可以作为配体去结合相应的位点，借此起到相似的结构调节作用。同时，还可以稳定蛋白复合物结构并阻止激酶自体磷酸化所导致的后续一系列构型变化，从而减少样品的异质性，以及提高结构的解析度。

基于这一思路，首要重点在于了解抑制剂和 DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基的相互作用。其中的难点包括蛋白本身较灵活、存在高取向偏好、有机溶剂耐受性差等。

在尝试多种样品制备方法和实验优化方法之后，梁世康终于得到了稳定可重复的实验条件，借此解析出一系列 DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基/配体和抑制剂的复合物结构，其中包括处于临床一、二期的特异性抑制剂。

接下来，他选择了能对蛋白构型起到最稳定效果的新型抑制剂，并对继续迭代实验条件，最终完成了这项工作 [2]。

相关论文以《人类 DNA 依赖性蛋白激酶激活机制》（Human DNA-dependent protein kinase activation mechanism）为题发在Nature Structural & Molecular Biology 上。论文作者只有两位：梁世康以及导师Thomas Blundell，这也是梁世康独立完成的一项工作。



图 | 相关论文（来源：Nature Structural & Molecular Biology）


现今冷冻电镜之发展，如同 60 年前晶体学之发展

梁世康表示：“我们组从 2001 年左右就一直在研究 DNA 依赖性蛋白激酶亚基的晶体结构。2015 年我加入 Tom 课题组读博时，主要课题之一就是研究 DNA 依赖性蛋白激酶和相关蛋白复合物的晶体结构，但是课题进展非常缓慢，耗时耗力还拿不到好的结晶条件。”

直到 2018 年，该团队所在院系搭建了完整的冷冻电镜实验平台，这终于让梁世康得以拥有研究电镜结构的条件。

他说：“Tom 很支持我学习冷冻电镜的知识、样品制备和数据处理。前期学习花了不少时间成本和试错成本。读博后期，Tom 也鼓励我继续留在组里做博后，这让我免去了很多后顾之忧。”

此外，梁世康认为 AI 的发展对于结构生物学来说简直是如虎添翼，这大大减轻了结构生物学家结构建模的工作量。也让之前几代结构生物学家们经年累月攒起的大量实验结构数据，可以继续发挥价值和指导作用。

当然，AI 能做的事情还有很多，比如高阶多蛋白复合物的结构预测、蛋白和小分子的相互作用预测、基于结构的药物分子设计、以及蛋白构型的动态变化。

除了结构预测之外，AI 在解析结构实验数据、冷冻电镜图像处理和断层扫描分析中，也起着越来越重要的角色，说不定将来实验数据处理都能实现自动化、标准化，从而大大加速科研效率。

如今的冷冻电镜发展就如同 60 年前晶体学的发展，冷冻电镜单颗粒分析和电子断层扫描相关技术的蓬勃发展再加上 AI 的助力，让梁世康相信结构生物学的发展会越来越精彩。

而他也将继续趁热打铁，进一步了解 DNA 依赖性蛋白激酶自体磷酸化对于 DNA 断裂修复影响的分子机理。在应用层面，他将协同下游的医药合作者，针对 DNA 依赖性蛋白激酶开展新型药物分子的研发。

参考资料：
1.Liang, S. et al. Structural insights into inhibitor regulation of the DNA repair protein DNA-PKcs.Nature (2022) DOI: 10.1038/s41586-021-04274-9
2.Liang, S., Blundell, T.L. Human DNA-dependent protein kinase activation mechanism.Nat Struct Mol Biol 30, 140–147 (2023). https://doi.org/10.1038/s41594-022-00881-w