基于蛋白质组学的药物靶点发现新策略

睡鱼

通过与体内的靶蛋白结合，药物能够改变靶蛋白和下游蛋白的活性，从而达到终止疾病发生发展的目的[1]。目前，有效化合物的发现主要有两种方法：基于靶点（target-based discovery）和基于表型（phenotypic-based discovery）的发现[2]。在基于靶点的发现中，通过抑制/降解特定的蛋白质或生物学过程，以验证其与疾病的关联，随后测量化合物文库对这些目标的活性，这是典型药物发现的第一步；相反，基于表型的发现则是通过观察不同化合物对人类或疾病模型的治疗效果（例如以细胞死亡为观察终点），实现对化合物的验证和筛选。无论采用何种方法，识别能够与有效化合物结合的蛋白质靶点（target deconvolution），对于新药研发、药物的临床应用、药物的作用机制和疾病的致病机理都有重要意义[3,4]，尤其是在化合物优化以及识别脱靶方面。
在过去十多年的药物发现中，基于表型的发现在很大程度上被基于靶点的发现所取代[5]，由于表型药物发现分析无法阐明化合物的作用机制，出现了以化学蛋白质组学、热蛋白质组学为代表的直接发现策略和评估蛋白质特性及功能（包括丰度、定位、修饰、相互作用等）为代表的间接发现策略，以达成发现化合物作用靶标、验证化合物作用机制的目的。
基于化学修饰探针的靶点发现策略

通过使用反应性或高亲和性的化学探针和基于质谱的蛋白质组学方法，化学蛋白质组学能够在复杂的生物系统中直接识别化合物的靶标（脱靶）， 为后续药物靶点结合（drug-target engagement）、药物选择性（drug selectivity）及药物再利用（drug repurposing）等分子机制研究和应用提供基础[6]。基于活性的蛋白质分析（activity-based protein profiling, ABPP）是用于化合物靶点发现的最通用的化学蛋白质组方法之一，通过将探针分子与细胞提取物孵育，利用点击化学技术（click chemistry）将探针-靶标复合物与生物素相连，随后使用链霉亲和素珠进行富集并使用质谱进行蛋白质鉴定；由于与化合物孵育后的蛋白质靶点无法再与探针结合，利用竞争结合的原理可以直接寻找化合物的靶点（图1）。


基于活性的蛋白质分析由Cravatt和Bogyo首创，最初的探针仅针对各种酶类（包括水解酶、蛋白酶、激酶等）的活性位点，能够直接在复杂的生物系统中读出大量活性酶的功能状态。使用这种策略，许多疾病中失调的酶活性及其抑制剂得到发现[7]。最近的探针已不再仅关注活性位点，而是使用广泛反应的化学探针（例如特定的活性氨基酸）直接在蛋白质组范围内发现靶标。例如，通过对抗癌物nimbolide的ABPP分析发现，nimbolide与E3泛素连接酶RNF114的第8位半胱氨酸（RNF114-Cys8）发生反应，后者对底物识别至关重要，nimbolide与RNF114-Cys8的结合能够破坏RNF114的底物识别进而抑制泛素化和肿瘤抑制因子（如p21）的降解，发挥抗癌作用[8]。ABPP 还可用于识别脱靶并评估化合物的选择性。例如，对依鲁替尼（BTK激酶抑制剂）处理的小鼠脾脏组织ABPP分析发现，BTK Cys481 是依鲁替尼配体最多的半胱氨酸之一；此外，与BTK 具备类似特征（ATP 结合口袋中含有一个半胱氨酸）的B淋巴细胞激酶BLK也被确定为依鲁替尼的脱靶[9]。
基于蛋白质热稳定性的靶点发现策略

基于化学修饰的化学蛋白质组展现出了强大的实力，但该方法依赖于人工合成的小分子，耗时耗力，且可能会导致药物活性的改变，需要有更为便捷的靶点识别策略。热蛋白质组学（thermal proteome profiling，TPP），也称之为细胞热迁移测定（cellular thermal shift assay，CETSA）就是其中一种引人注目的新兴技术。热蛋白质组学自2014年诞生以来[10]，就显示出了在药物的靶点和脱靶点发现中的独特优势，随着技术的不断发展，热蛋白质组学已可以在体外、原位和体内进行[11]。


基于蛋白质在与配体结合后稳定性增加的原理[10,12]，热蛋白质组学通过加热加药与未加药的细胞（或蛋白质提取物）并测量每个温度下剩余的可溶性蛋白质来评估蛋白质的热稳定性变化（图3），从而判断药物的靶点，这是唯一可以在活细胞甚至组织中进行药物靶点识别的生物物理学策略[15]。


由于其强大的靶点发现能力，热蛋白质组学被广泛应用于药物发现和基础生物学；在最初的热蛋白质组学方法上，创新出许多不同的范式（图4）。例如温度变化的热蛋白质组分析（TPP-TR）及化合物浓度变化的热蛋白质组分析（TPP-CCR）专注于分析单维度变化（单一化合物浓度/温度对应多个温度/化合物浓度）下蛋白质稳定性的变化，进而分析化合物的作用靶点；通过将二者组合衍生出了二维热蛋白质组（2D-TPP）[13]，能够同时分析温度和化合物浓度对蛋白质热稳定性的影响，从而实现了更为精确的量化，并直接估计化合物与蛋白质之间的亲和力 [10]。此外，通过汇集来自不同温度条件的样本，发展出了蛋白质组整体稳定性变化（PISA）的方法；通过将温度最低的样本作为桥接，扩充温度条件，发展出了混合热蛋白质组分析（Hybrid-TPP）的方法。


自热蛋白质组学技术诞生以来，它已识别包括人类在内的不同物种的的化合物靶标中（附表1），例如将亚铁螯合酶（FECH）鉴定为激酶抑制剂（如星形孢菌素或威罗非尼）的脱靶靶标，以及将苯丙氨酸羟化酶鉴定为组蛋白去乙酰化酶抑制剂帕比司他的脱靶靶标；这些蛋白质的抑制可能会导致药物不良反应，包括激酶抑制剂的肾毒性[14]或帕比司他的甲状腺功能减退症样症状[15]。特别的是，对蛋白质丰度变化及靶点的监测（即热稳定性的变化）在诸如蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）、分子胶（MGDs）等靶向蛋白质降解剂的评估有着巨大的潜力，例如通过对BET家族抑制剂JQ1进行热蛋白质组的分析发现了除靶蛋白BET家族蛋白BRD4之外的脱靶蛋白FYTTD1，而后者是mRNA从细胞核输出到细胞质所必需的TREX复合体的适配器之一。基于JQ1的PROTAC分子会导致FYTTD1的意外降解，并最终导致细胞蛋白质合成的完全静止（图5）[16]。


基于蛋白质稳定性的其他药物靶点发现策略

与热蛋白质组学类似的是，利用蛋白质与配体结合后稳定性增加的原理，开发出了药物亲和反应的靶点稳定性（Drug affinity responsive target stability，DARTS）（图6）[17]；不同的是，热蛋白质组通过加热评价蛋白质的热稳定性变化，而DARTS则将蛋白质暴露于蛋白酶下，由于与化合物结合后的蛋白质得到保护，因此可以通过蛋白质的丰度变化寻找化合物的靶点蛋白。


此外，利用甲硫氨酸残基容易氧化的特性，开发出了蛋白质氧化速率的稳定性分析（Stability of proteins from rates of oxidation，SPROX）（图7）[18]的方法，通过将蛋白质暴露于氧化环境下（如过氧化氢），可以借由甲硫氨酸残基氧化修饰的比例变化，寻找化合物的靶点蛋白。但SPROX检测存在天然的缺陷，由于SPROX仅关注含有甲硫氨酸残基的肽，约占肽的三分之一，在目前缺乏富集技术的情况下无疑给质谱检测带来一定的挑战；此外只有那些暴露于氧化环境下的甲硫氨酸才能提供有效信息，因此会不可避免损失许多潜在靶点的信息。


结语

尽管基因组提供了细胞生化活动的丰富信息，但细胞中存在的转录水平、翻译水平、和翻译后修饰的调节，导致基因组的信息往往不能真实反映细胞的动态变化。因此，研究生命活动执行者——蛋白质，在解析生物活性化合物（如小分子药物或肽）的功能机制（确定可能的蛋白质靶点）有着不可或缺的重要意义；随着近十年来质谱技术的飞速发展，基于质谱的蛋白质组学技术在速度、灵敏度、精确度和稳健性上取得了长足进步，越来越多的成功案例证明了基于蛋白质组学的策略能够在药物靶点发现中发挥巨大作用，并极大地缩短从命中到引导到候选的周期，减少了后期损耗，提高了药物研发的成功率。
附表1 使用热蛋白质组发现的化合物蛋白质靶点 [19]



参考文献

1. Modification-free approaches to screen drug targets at proteome level. Trac Trends Anal Chem, 2020, 124: 115574.

2. The emerging role of mass spectrometry-based proteomics in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 2022 Sep;21(9):637-654.

3. A comprehensive map of molecular drug targets. Nat Rev Drug Discov, 2017, 16(1): 19-34.

4. A perspective on multi-target drug discovery and design for complex diseases. Clin Transl Med, 2018, 7(1): 3.

5. Phenotypic drug discovery: recent successes, lessons learned and new directions. Nat Rev Drug Discov. 2022 Dec;21(12):899-914.

6. Clinical chemoproteomics-Opportunities and obstacles. Sci Transl Med. 2017 Apr 19; 9(386): eaaf7951.

7. Enzyme inhibitor discovery by activity-based protein profiling. Annu Rev Biochem. 2014;83:341-77.

8. Harnessing the anti-cancer natural product nimbolide for targeted protein degradation. Nat Chem Biol. 2019 Jul;15(7):747-755.

9. Reimagining high-throughput profiling of reactive cysteines for cell-based screening of large electrophile libraries. Nat Biotechnol. 2021 May;39(5):630-641.

10. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science, 2014, 346(6205): 1255784.

11. Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions. Mol Syst Biol, 2020, 16(3): e9232.

12. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science, 2013, 341:84–87.

13. Thermal proteome profiling for unbiased identification of direct and indirect drug targets using multiplexed quantitative mass spectrometry. Nat. Protoc. 2015, 10:1567–93.

14. Nephrotoxicity of the BRAF-kinase inhibitor Vemurafenib is driven by off-target Ferrochelatase inhibition. 2021, bioRxiv 428783.

15. Identifying drug targets in tissues and whole blood with thermal-shift profiling. Nat. Biotechnol. 2020，38:303–8

16. Multiplexed Proteome Dynamics Profiling Reveals Mechanisms Controlling Protein Homeostasis. Cell. 2018 Mar 22;173(1):260-274.

17. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Dec 22;106(51):21984-9.

18. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 2011 Jan; 6 (1): 34–46.

19. Drug Target Identification in Tissues by Thermal Proteome Profiling. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2022 Jan 6; 62: 465-482.