细胞疗法系列—NK细胞篇01

郑州科威

近期会更新一系列细胞治疗相关的综述，短评，介绍，包括NK细胞，T细胞，MSC细胞，外泌体等，欢迎大家关注。
摘要
自然杀伤（NK）细胞是一类免疫效应细胞，在异常细胞的免疫清除中起着关键作用。与T细胞激活不同，NK细胞的激活由NK受体与靶细胞相互作用而调节，与抗原处理和呈递无关。由于激活所需的信号较为简单，所以NK细胞在癌症免疫治疗领域中受到了广泛关注。目前，大量的研究机构以及药企，正在致力于开发基于NK细胞的癌症免疫治疗。下面，我们简要介绍关于NK细胞的生物学特性，正在进行的基于NK细胞的癌症免疫治疗的临床前和临床研究的进展，挑战和未来前景。
背景
自然杀伤细胞（NK）是肿瘤免疫监控的重要组成部分，在小鼠模型和临床研究中表明， NK细胞活性降低与肿瘤易感性和转移率呈现正相关。NK细胞利用一系列固有表面受体识别并迅速作用于恶性肿瘤细胞，而不需要预先抗原处理和呈递。激活后，NK细胞释放细胞毒颗粒，包含穿孔素和颗粒酶，以类似于细胞毒性T细胞活化的方式直接杀伤肿瘤细胞。NK细胞还可以产生大量趋化因子和细胞因子如干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α），从而在调节适应性免疫反应方面发挥关键作用。由于NK细胞固有的消除肿瘤细胞的能力，NK细胞作为抗癌免疫疗法已经开发研究了数十年。早期临床试验已经证明了NK细胞输注的总体安全性，即使在基因基因编辑后移植的情况下也是比较安全的。基因编辑NK细胞的可行性、安全性和NK细胞的快速杀伤肿瘤的特性，使得开发“现货型”NK细胞抗癌免疫疗法极具前景。然而，这个开发过程需要克服许多挑战，例如NK细胞难以达到临床使用级别的体外扩增，有限的体内存留，有限的细胞活性、有限的浸润实体瘤和肿瘤逃避的问题。为了提高NK细胞治疗的效果，业内正在采用各种策略克服这些挑战，例如使用细胞因子和/或小分子药物进行体外预处理，工程化“现货型”或iPSC分化的嵌合抗原受体（CAR）-NK。近年来，NK细胞免疫疗法的发展有了爆炸性增长，在临床前和临床开发中都取得了进展。
NK细胞细胞生物学特性
四十多年前，NK细胞被鉴定为淋巴细胞，具有天然杀伤肿瘤细胞的能力，无需预先激致敏。NK细胞可以通过释放包含颗粒酶和穿孔素的细胞毒性颗粒以及通过死亡受体介导的途径（例如FasL / Fas）来触发靶细胞死亡。NK细胞还通过分泌趋化因子和细胞因子（例如RANTES和IFN-γ）发挥免疫调节功能。
在人体中，NK细胞通常通过流式细胞术鉴别，其特征是表面CD3-CD56+。在小鼠中，CD3- NK1.1+是区分NK细胞的标准标志。在NK1.1-小鼠品系中（例如BALB/c），则使用CD49b识别NK细胞。天然细胞毒素NKp46也经常用于与CD3表达的缺失组合用于识别小鼠和人类NK细胞。值得注意的是，某些组织（如黏膜屏障）存在一些固有淋巴细胞(ILCs)，这些细胞也和NK细胞的表达相似的标记。例如，分泌IL-22的人ILC3的一个亚细胞集落分子标记为CD56 + NKp46 + CD3。其他标志物，如缺乏c-kit，可用于区分人类NK（c-kit-)和ILC3（c-kit +）。在小鼠中，NK和ILC1均为NK1.1 +CD3，但可通过CD49a和Eomes表达进一步鉴定。NK细胞为CD49aEomes +，而ILC1为CD49a + Eomes。
NK细胞在血液中占循环淋巴细胞的5%-15%，并且存在于各种淋巴和非淋巴器官，如脾脏、肺和肝脏。根据对外周血NK细胞的表征，人类NK细胞通常被分为两个主要亚群：CD56brightCD16dim/和CD56dimCD16+，前者被认为是不成熟NK，但能产生大量的细胞因子；后者则更成熟并且最具有细胞毒性。大多数血液中的NK细胞是CD56dim，而CD56bright亚群仅占总循环NK细胞的不到15%。组织中CD56bright和CD56dim NK细胞的相对比例可能与外周血观察到的不同。值得注意的是，现在已经证明许多组织驻留的NK亚群在表型和功能上与传统的外周血NK细胞有所不同。例如，子宫NK细胞是CD56bright，是妊娠期间子宫中淋巴细胞的主要成分，通过调节胎盘血管重塑在妊娠中发挥重要作用。
NK细胞是生存周期很短的先天淋巴细胞，缺乏抗原特异性。最近的研究发现，成熟NK细胞的一个亚群在CMV感染的特定情况下，可以引发长期的“适应性”特性。研究表明，“适应性”样NK细胞表达激活受体NKG2C，而NKG2C+ NK细胞的“适应性”特性归因于非经典MHC I分子HLA-E向NKG2C+ NK细胞递呈CMV特异性病毒肽。在HCMV血清阳性个体的循环系统中可以检测到NKG2C+ NK细胞。
NK细胞起源于CD34+造血干细胞，骨髓是NK细胞发育的主要场所。最近的证据表明，NK细胞也可以在次级淋巴器官，包括扁桃体、脾脏和淋巴结中发育和成熟。NK细胞前体经历不同的发育阶段，并逐渐表达表面受体，我们也是主要通过这些受体来定义NK细胞亚群，如NK1.1和CD56。与T细胞不同，没有主要转录因子调控NK细胞的发育。相反，一组转录因子，包括T-bet、Eomes、E4BP4、Id2和BLIMP，参与调控 NK细胞的发育和成熟。共同的γ链细胞因子，如IL2、IL-7和IL15，以及它们的受体，包括CD122和CD127，在NK细胞的发育和稳态中发挥重要作用。尽管研究了几十年，但人类NK细胞的发生发育仍未完全解析清楚。传统的线性发育模型认为，成熟的NK细胞是通过从共同淋巴祖细胞（CLPs）沿着线性连续发育而来的。线性发育模型认为CD56标记了NK细胞从不成熟到更成熟的转变，即不成熟的CD56bright NK细胞进一步分化为成熟的CD56dim群体。最近的证据挑战了这种观点，并提出了更多支化发展的可能性，即CLPs和共同髓系祖细胞（CMPs）都可以产生NK细胞前体。而且，不同的前体群体独立地发育成不同的成熟NK细胞亚群。
NK细胞受体及其激活
NK细胞表面表达有一系列抑制性和激活性受体（表1）。与T细胞受体截然不同，NK细胞受体是种系编码的“硬连线”受体，无需“V（D）J”重组。这些受体连接后，传递抑制或激活信号进而调控NK激活。来自配体/受体相互作用的激活和抑制信号的整合和平衡决定了NK细胞的激活状态。例如，健康细胞不表达或表达最低水平的NK细胞激活受体的配体，但表达高水平的主要组织相容性复合体I类分子（MHC I），也称为人类白细胞抗原（HLA），它与NK细胞上的杀伤免疫球蛋白样（KIR）家族抑制性受体结合，进而使得NK细胞产生抑制性信号，而不攻击健康细胞。。相反，瘤细胞或病毒感染细胞下调MHC I的表达，但上调NK细胞激活受体配体水平，因此由于缺乏抑制信号和/或存在激活信号而触发NK细胞激活。在异体移植中，利用供体和受体之间KIR和HLA不匹配，可以增强供体NK细胞活化进而强力杀伤患者肿瘤细胞。NK细胞还通过利用Fcγ受体进行抗体依赖性细胞毒性（ADCC），在抗体介导的癌症治疗中发挥重要作用。



表1：人NK细胞表面受体及其配体

NK细胞免疫治疗的临床前研究
目前 NK 细胞治疗的临床前研发主要受早期临床研究的启发。在了解了 NK 细胞的激活方式之后，最初的 NK 细胞治疗是在造血干细胞移植 (HSCT) 临床研究中率先开创的，其中 NK 细胞显示出能够发挥移植物抗白血病作用的能力。研究表明， KIR 不匹配的异基因供体 NK 细胞能够有效的避免骨髓移植的 AML 患者复发，同时避免了移植物抗宿主病 (GVHD)。Miller团队更进一步开创了在非移植环境中使用 NK 细胞的方法。他们表明，在高剂量环磷酰胺和氟达拉滨的预处理后，输注来自 HLA 半相合异基因供体的 NK 细胞，结合皮下给与IL2，可成功扩增供体 NK 细胞，使 19 名预后不良的急性髓系白血病 (AML) 患者中的 5 名完全缓解。同时，NK 细胞在体内扩增和存留，需要进行有效的淋巴减灭预处理。因为接受较弱预处理的患者NK 细胞在体内扩增和存留失败。目前研究者认为，移植的成功需要创建一个淋巴细胞减少的环境，以提供NK细胞一个生存和增殖的基础。
通过NK细胞治疗血液癌的成功，研究者开始开发NK细胞治疗实体瘤策略。在体外，NK细胞对各种实体瘤细胞具有细胞毒作用。通过移植NK细胞，NK细胞的抗肿瘤活性在卵巢癌、胶质母细胞瘤和转移性结直肠癌的小鼠模型中也得到了证明。虽然NK细胞免疫治疗的安全性已在自体和半相合异基因移植临床实验中得到证明。然而，NK细胞治疗实体瘤的临床疗效迄今仍然有限。下面的部分总结了目前的一些临床前研究，旨在增强NK细胞免疫治疗的疗效。
CAR-NK细胞是CAR-T疗法的最有前景的竞争者
CAR-T疗法已被证明对特定血液癌症患者具有良好的疗效。两种CD19靶向CAR-T产品已被FDA批准用于治疗B细胞淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病（ALL）。然而，CAR-T细胞疗法存在两个主要挑战：（i）需要大量时间来生产治疗剂量的自体CAR-T细胞，从而限制了其治疗快速进展疾病患者的可行性；（ii）很难从经过重度化疗、放疗，淋巴细胞减少的癌症患者中获取足够数量的自体T细胞进行CAR-T细胞生产构建。作为CAR-T细胞疗法的替代品，CAR-NK细胞疗法不仅不具备这些问题，而且还具有额外的突出优势：（i）能够无限的使用同种异体来源NK而不用担心GVHD；（ii）可以生产“现货型”产品，使用NK细胞系或iPSC-NK；（iii）相对缩短的生产周期；（iv）通过NK细胞受体识别和杀死肿瘤细胞，与CAR无关，因此，与CAR-T细胞疗法相比，癌细胞更不太可能通过下调CAR抗原导致免疫逃逸。
与CAR-T细胞类似，CAR-NK细胞可以通过基因改造表达CAR结构，CAR识别特定抗原，该抗原由靶细胞特异表达或过表达。在大多数临床前研究中，使用慢病毒或逆转录病毒转导来实现NK细胞中CAR的稳定和持续表达。非病毒载体基因传递方法，如转座子系统和mRNA电穿孔，也被用于CAR-NK细胞的构建。在临床前研究中，针对血液系统恶性肿瘤和实体瘤，CAR-NK细胞已经被用于靶向各种肿瘤抗原，如表2所示。CAR-NK细胞的抗原识别区通常由单链抗体片段（scFV）分子组成，这些分子源自单克隆抗体，也有少量的研究使用了纳米抗体。对于血液系统恶性肿瘤，CD19仍然是主要的靶标。EGFRvIII、间皮瘤素和Her2等抗原已被CAR-NK细胞针对性地用于实体瘤的治疗，包括结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌和胶质母细胞瘤等。CAR-NK细胞的信号结构域与CAR-T细胞非常相似，通常由CD3ζ与一个或两个TCR共刺激分子融合而成，如CD28、4-1BB、2B4、DNAM1和NKG2D。在这些TCR细胞共刺激分子中，4-1BB、DNAM1、2B4和NKG2D也是NK细胞原始表达的激活受体。研究表明，构建的hMesothelin-CAR-NK细胞，带有NK细胞原始表达的激活受体信号，如NKG2D-2B4，与带有CD28-CD137的细胞相比，其在体外和体内表现出更优异的抗肿瘤活性。带有NKG2D-2B4的CAR-NK细胞具有更高的Syk和Erk1/2磷酸化水平。



表2：临床前研究验证过的CAR-NK细胞

除了通过针对肿瘤抗原来制导CAR-NK细胞的细胞毒作用外，有人提出可以利用CAR-NK细胞消除肿瘤微环境中的免疫抑制性免疫细胞，包括髓样来源抑制细胞(MDSCs)和M2型肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)。Parihar及其同事设计了表达激活受体NKG2D作为抗原识别的CAR-NK细胞，以靶向人MDSCs。他们在体外实验、以及移植有人类神经母细胞瘤和MDSCs的小鼠模型中证明，NKG2D CAR-NK细胞可以有效杀伤人MDSCs。此外，CAR-NK细胞分泌促炎细胞因子和趋化因子，这可能会提高随后输注的CAR-T细胞在小鼠模型中的浸润和功能。有人提出，CAR-NK细胞可以与针对实体瘤的T细胞疗法相结合使用。
杀手细胞结合物释放NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用
虽然CAR-NK细胞作为未来的“现货型”药物具有很大的潜力，但也存在NK细胞特有的问题，比如在冷冻-解冻过程中潜在的活力和/或活性丢失以及体内缺乏持久性。为了解决这些问题，双特异性和三特异性杀手细胞结合物(BiKE和TriKE)应运而生。BiKE或TrikE由不同抗原特异性的两个或三个链接的单链抗体可变片段组成。当前正在开发的BiKE或TrikE同时与CD16和肿瘤抗原结合，从而诱导免疫突触的形成和抗体介导的ADCC。在临床前研究中，已经设计了各种BiKE和TriKE以针对多种肿瘤抗原：针对血液系统肿瘤的CD19、CD20和CD33，以及针对实体肿瘤的HER2、EGFR和EpCAM。细胞因子，如IL15，也被纳入杀手结合物中以进一步增强NK细胞功能。Vallera等人报告说，一种CD16/IL-15/CD33 TriKE不仅增强了NK介导的针对CD33+细胞的杀伤，而且通过自分泌IL-15还促进了NK细胞的体内留存、激活和存活。这种TriKE设计(GTB-3550)目前正在用于治疗高风险的血液系统恶性肿瘤(NCT03214666)的临床试验中。三功能NK细胞结合物(NKCE)，可交联NKp46和CD16，与针对单一抗原的传统单克隆抗体相比，已经表现出优越的体内和体外抗肿瘤活性。
NK细胞“启动”策略
CAR技术的目的在于增加细胞的靶向特异性，同时转导杀伤信号，来增强NK细胞的功能。除此之外，研究人员也开发了一系列的方法，希望能够在体外或体内“启动”NK细胞，以实现最佳的抗肿瘤功能。研究也表明，新鲜分离的静息状态的NK细胞通常比通过各种策略“启动”的NK细胞的裂解能力要弱。
细胞因子介导的NK激活是最常用，也是研究最为广泛的NK激活方法。在许多研究中，NK细胞在体外扩增时通常会添加IL-2或IL-15，有时在NK细胞回输后也会添加。已经证明，IL-15/IL-15Ra融合复合物ALT-803不仅可以在体外和体内增强NK细胞功能，而且短期（18-20小时）的ALT-803预激活可以增强NK细胞在体外的细胞毒性和ADCC。在淋巴瘤的小鼠异种移植模型中，ALT-803与NK细胞的联合给药显著增强了针对CD20的NK细胞介导的ADCC效应。最近的研究也证明，使用IL-12/15/18混合物预激活的小鼠和人类NK细胞，在体内/体外的抗肿瘤效应都显著增强且能够持续。据推测，细胞因子预激活的N细胞是有一定的“记忆性”的，其在初次预激活后数周或数月内，对细胞因子或激活受体的再激活具有增强的效应。
除了细胞因子的激活的策略外，Cichocki团队证明，使用GSK3激酶抑制剂CHIR99021，可促进人类外周血NK细胞的体外扩增和晚期成熟，并增强它们在体内外的抗肿瘤效应。在GSK3抑制剂存在下使用IL-15扩增的人类NK细胞与单独使用IL-15扩增的NK细胞相比，CD57标记和晚期NK细胞成熟相关的转录因子，包括T-bet、ZEB2和BLIMP-1的表达量都有增加。Fate公司就是使用GSK3抑制剂来生产FATE-NK100，该药正在进行1期临床试验，作为单一疗法或与单克隆抗体联合使用，用于晚期实体肿瘤患者（NCT03319459）。
虽然大多数NK细胞外体扩增的预处理策略是使用一种或多种细胞因子，但一些研究也表明，细胞因子并不是NK细胞预处理的关键。一项研究表明，将白血病细胞系CTV-1或其裂解物与NK细胞一起孵育过夜，而不加细胞因子，足以使NK细胞在体外对原本不敏感的肿瘤细胞产生强烈的细胞毒性，但不会对正常造血细胞产生影响。CTV-1介导的NK细胞预处理的机制尚不清楚。有人认为，在CTV-1肿瘤细胞激活的NK细胞中，CD69的表达对于其细胞毒性是及其重要的。基于这些临床前的发现，从HLA半相合供体中获得的CTV-1裂解物预处理的人类NK细胞（CNDO-109-NK细胞）正在开展1期临床试验（NCT01520558），该试验适应症为在首次完全缓解后出现复发的高危AML患者。结果发现CNDO-109-NK细胞耐受良好，未出现剂量依赖性毒性。12名患者中有3名出现持久完全缓解。
增强NK细胞浸润和功能的方法
除了对NK细胞进行工程化改造和预处理外，通过改造趋化因子-趋化因子受体轴向来改善移植NK细胞的肿瘤浸润也是一种创新性的思路。Lee等人开发了一种NK细胞招募蛋白偶联抗体（NRPbody），结构包含一个介导肿瘤靶向的Meso-scFv和趋化因子CXCL16的连接，中间由酶切位点连接。Mesothelin是一种在几种人类癌症（包括恶性间皮瘤、胰腺、卵巢和肺腺癌）中高度过表达的肿瘤抗原。NRPbody一旦与过表达mesothelin的肿瘤细胞结合，furin介导的酶促裂解会释放NRPbody中的CXCL16，并将NK细胞招募到肿瘤部位。此外NRPbody在体外促进了NK细胞的迁移，并在胰腺癌原位模型和皮下裸鼠模型中促进了其浸润到肿瘤部位。在裸鼠模型中，NK细胞输注结合NRPbody腹腔注射，与非可切割的NRPbody对照相比显著降低了肿瘤负荷。此外，还需要研究确定NRPbody如何与TME中更复杂和真实的免疫环境相互作用，在TME中不仅仅是NK细胞，CXCL16在肿瘤模型中还与单核细胞和M2型巨噬细胞的浸润相关。一些研究已经试图通过基因编辑改造NK细胞来过度表达趋化因子受体，以增强NK细胞向肿瘤的迁移。在一项研究中，Ng等人表明，经过基因改造表达趋化因子受体CXCR1的CAR-NK细胞在体外和体内具有比对照组CAR-NK细胞更强的迁移能力。在皮下喉癌移植模型中，表达CXCR1的CAR-NK细胞显示出比对照组CAR-NK细胞更强的肿瘤浸润和肿瘤抑制作用。目前大量研究希望通过针对TME中的免疫抑制成分来重新激活NK细胞的功能。TME中一个主要的免疫抑制因子是代谢物腺苷酸，它的产生是由外切酶CD39和CD73顺序催化的。腺苷酸会削弱T细胞和NK细胞的抗肿瘤功能。Wang等人证明，通过抗体介导的CD73阻断显著增强了NKG2D工程化的CAR-NK92细胞在体内和体外的抗肿瘤活性，并且在体内提高了CAR-NK细胞对肿瘤的浸润
临床级NK细胞扩增
NK细胞的临床级规模化扩增，同时保持良好的细胞活性的是开发临床应用的主要挑战。目前的开发策略因临床需求和细胞来源而异。新鲜分离的、激活的或体外扩增的NK细胞群体表现出表型和功能上的差异。这些差异也源于激活方法，如白细胞介素的选择、它们的组合、滋养细胞类型以及其他一些因素。目前用于免疫疗法的NK细胞的来源和特征、扩增和激活方法见表3和表4。



表3：不同来源NK细胞比较



表4： NK细胞激活与扩增方法

供体来源NK细胞
供体NK细胞的主要来源是通过分离外周血液的纯化NK。研究表明，使用异基因NK细胞进行免疫治疗，在经过一夜的细胞因子孵育后，不需要进行扩增即可激活NK细胞并增强其对肿瘤靶细胞的细胞毒性。然而，不进行扩增，用于治疗的NK细胞剂量则受到限制。随着激活和扩增方法的改进，从单个供体采血可以制备越来越高的NK细胞数量用于免疫治疗。为了避免由异基因T细胞引起的GVHD等严重副作用，或由供体B细胞引起的“过客淋巴细胞综合征”，建议在扩增之前纯化异基因NK细胞，以将CD3阳性细胞限制在每千克1-5 x 105以下。NK细胞的纯化通常通过磁珠法去除CD3阳性细胞，然后富集CD56阳性细胞或通过荧光激活细胞分选实现。
脐带血是NK细胞的另一个重要来源，脐血NK已被大量用于临床应用。无论是脐带血还是胎盘源细胞都含有一定比例的NK前体细胞，在成熟和扩增阶段有分化成NK细胞的能力。通常情况下，一份脐带血或胎盘供体可扩增到足够进行一次免疫治疗的剂量。例如，分离的胎盘NK细胞经过21天的培养平均可产生1.2×109个NK细胞，生存率约为80%，而来自脐带的NK细胞的平均纯度为92.37%，可扩增至1.59×1010个
iPSC-NK细胞来源
供体NK细胞在功能和扩增潜力上存在一定的局限性。在临床应用时，每个批次都需要经过验证，这会导致患者接受输注的周期延长。此外，有限的扩增能力使得通过基因改造的方法来提高NK细胞的效力变得不易实现。CAR-NK是提高NK细胞的效力常用方法。使用已基因修饰的NK细胞系CAR-NK92可以轻松扩增到大剂量，CAR-NK92已经在临床试验中使用。然而，NK92是一种转化的细胞系，具有与其肿瘤性质和细胞遗传学异常的局限性，因此需要辐照才能在临床上使用，这限制了它的在体寿命。因此，研究人员也研究了诱导多能干细胞（iPSC）分化为NK细胞的方法，以解决这些局限性。iPSC具有无限制的自我更新和多向分化能力，因此可以提供源源不断的NK细胞。这种方法还允许研究人员编辑细胞的基因组，以优化细胞治疗的效果。
作为一种新的NK细胞来源，iPSC分化出的NK细胞（iPSC-NK）可以解决许多与NK细胞治疗相关的挑战。从概念上讲，iPSC-NK可以提供一个均一分化的NK细胞群体，同时可以扩展到临床使用级规模，作为一种“现货型”NK细胞，克服NK-92细胞系的局限性。多个团队已经证明从人类胚胎干细胞(hESCs)和iPSCs分化出具有功能的NK细胞。通常情况下，分化是在通过拟胚体进行的，或通过OP9小鼠基质共培养来实现的。最近，通过iPSC单层贴壁培养也实现了NK细胞的分化。贴壁培养的优点是提供了分化环境明确。这种方法已经实现了超过15％的CD34+造血祖细胞，而其他方法只能产生多达4％的CD34+。iPSC分化技术的出现，允许在多能干细胞状态下进行基因修饰和无限扩展，为提供临床规模的NK细胞生产提供了一个全新的框架。经过CAR工程化的iPSC-NK细胞已经在临床前研究中展示了对肿瘤的有效性。iPSC-NK细胞技术的另一个重要特征是能够优化分化策略，从而操控所得产品的表型和功能。例如，使用GSK3b抑制剂增强Wnt信号通路可诱导定向血系分化，在这种条件下分化的NK细胞具有更明显的炎性细胞因子表型，而未激活Wnt的NK亚群，类似于原代胎儿NK细胞，细胞毒性增强的偏向。这种改变分化方向的能力使得生产长时程驻留NK或器官特异性NK细胞成为可能。
多能干细胞的无限增殖能力，使得各种基因修饰，开发治疗一系列疾病的现成单倍型细胞库成为可能。目前有多个使用iPSC-CARNK细胞的癌症免疫治疗临床试验正在进行。
细胞因子介导的NK扩增与激活
正如前面所述。细胞因子是NK细胞增殖和激活的重要因素，细胞因子可以诱导NK细胞的短期激活，但在没有滋养细胞的条件下无法有效扩增。白细胞介素-2（IL-2）是最早也是最重要的用于NK维持扩增的细胞因子之一，对于NK细胞的存活至关重要。FDA批准了两种细胞因子，IL-2和α-干扰素（IFN-α），用于治疗多种恶性疾病。几十年前，IL-2就被用于诱导淋巴因子激活杀手（LAK）细胞，一种由NK、NKT和T细胞组成的异质性细胞群，用于自体杀手细胞为基础的癌症治疗。LAK细胞的抗肿瘤作用主要归因于NK细胞。值得注意的是，IL-2主要激活NK细胞的细胞毒性，同时支持NK和T细胞的增殖。仅使用IL-2扩增NK细胞的效果相对较弱，NK细胞只能在含1000 U/mL IL-2的培养基中分裂数次。IL-21对人类NK细胞有各种影响。一方面，IL-21可以增强干扰素γ（IFN-γ）产生、细胞杀伤功能和抗体依赖性细胞毒性（ADCC）反应。另一方面，IL-21对NK细胞的存活作用有限，而且在更高剂量（50 ng/mL）下会触发NK细胞的增殖停滞和凋亡。IL-21与IL-2或IL-15的联合作用具有累积的激活效应。研究表明，使用IL-21和IL-15联合诱导CD3去除的外周血单个核细胞（PBMC）培养13-20天，可实现NK细胞3.7倍的扩增，具有延缓白血病进程的作用。IL-2/IL-15/IL-21的组合可以支持NK细胞的最多8倍扩增。最近的研究表明，使用IL-15/IL-18/IL-27的细胞外刺激可以实现NK细胞17倍的扩增，而IL-2与IL-18的组合可以在两周时间内实现NK细胞约500倍的扩增。在培养中存在自体滋养层细胞（通常是CD3去除的PBMCs）可以进一步促进NK的扩增。
研究表明，膜结合的白细胞介素能够更有效地刺激NK细胞的扩增。Campana等人的一项研究表明，基因修饰K562细胞，过表达NK刺激分子4-1BB配体和IL-15，并用该细胞刺激NK细胞，在7天的培养期内，NK细胞中位数扩增率为21.6倍，经过3周的培养后，可以获得超过1000倍的NK细胞扩增。使用K562膜结合IL-21和4-1BB配体可以在3周内获得超过30,000倍的NK细胞扩增。这就使得一次外周血采样，就可以获得大量的NK细胞成为了可能。目前正在进行I/II期临床试验（NCT01787474），使用相同单倍体的扩增NK细胞治疗复发或难治性AML。此外，使用这种方法获得的NK细胞具有高度的细胞毒性，能够产生内源性的细胞因子，改善自身的存活、增殖和功能。
促进NK细胞扩增的其他方法
除了细胞因子用于NK细胞扩增，其他刺激物，包括肿瘤细胞、异基因淋巴细胞、抗体和微生物衍生物，也被用于增强NK细胞体外扩增。将NK细胞暴露于未修饰的K562中，可刺激其短期扩增。使用Wilms瘤HFWT和免疫缺陷的T淋巴细胞Jurkat细胞系，可实现NK细胞100多倍的扩增。埃皮斯坦-巴尔病毒转化淋巴细胞系（EBV-LCLs）尤其有效，可实现NK细胞高达3000倍的扩增，并且也被用于从冷冻的脐带血中大量生产的CD56+NK细胞。化学刺激物如康卡菜凝集素A（ConA）、植物血凝素（PHA）和ionomycin也可以和辐照后的异基因淋巴细胞结合使用，促进NK细胞活化。尽管在使用滋养细胞之前需要进行辐射，但为了安全起见，应评估滋养细胞的残留污染。应该开发灵敏的检测方法，以区分滋养细胞与扩增的NK细胞，以确保没有滋养细胞污染。例如，在使用CD19修饰的K562来滋养NK细胞时，通过流式细胞术检测NK细胞内源分子CD32和K562转基因CD19的表面表达来评估污染情况，以区分NK细胞和滋养细胞。其他方法包括自杀基因的使用或滋养细胞中荧光标记物的表达。尽管如此，无滋养细胞的方法是避免安全问题更可取的方法。解决安全问题的一种方法是使用裂解的滋养细胞产品。例如，使用K562细胞膜粒子作为滋养细胞，其中带有膜结合IL-21和4-1BB配体，在大约两周的体外培养后可实现NK细胞的激活和250倍的扩增。
刺激性抗体通常与辐照后的异基因外周血单个核细胞（PBMC）一起使用，以进一步促进NK细胞的活化和扩增。OKT3，一种针对CD3的抗体，常常被添加到辐照后的自体PBMC培养基中，可以促进NK细胞的扩增，扩增量可达1000倍以上。抗CD3 mAb可能会激活培养基中的T细胞分泌细胞因子，随后创造出有利于NK细胞扩增的环境。Masuyama等人报道了在PBMC刺激下使用抗CD3和抗CD56 mAb的组合，能够实现NK细胞大约1500倍的扩增。Lee等人使用辐照后的自体PBMC和抗CD16 mAb在2周内实现超过500倍的NK细胞扩增和超过98%的纯度，以及在3周内实现NK细胞超过5000的扩增。
一种更简化的NK细胞扩增方法是将A组链球菌和zoledronate与IL-2结合，以刺激脐血来源的单个核细胞。该方法在经过21天的体外培养后，可以实现为NK细胞的1560倍扩增，纯度为92.37%。这种方法的优点在于不需要磁性细胞分选、滋养细胞或多种细胞因子，可能降低生产成本。此外，IL-2，A组链球菌和zoledronate均已获得人类使用批准。对这种扩增后的NK细胞进行安全性和有效性的临床评估是可行的。
基于NK细胞的癌症治疗的临床进展
体外培养的NK细胞治疗产品oNKord，即来源于UCB-CD34+祖细胞的同种异体部分HLA匹配的NK细胞，已获得EMA和FDA针对无法接受同种异体干细胞移植的AML患者的孤儿药物认证。该认证基于临床研究结果，结果表明oNKord的1年生存率为80%，而对照组为35%。最近，FDA已经批准了CYNK-001胎盘扩增的NK细胞（CYNK-001）作为治疗胶质母细胞瘤（GBM）的新药申请。这一成功引发了大量的NK细胞治疗癌症的临床研究。目前，http://clinicaltrials.gov列出了100多项NK细胞免疫治疗癌症的临床试验。
基于 NK 细胞的血液恶性肿瘤临床试验
将供体来源为同种异体或自体的NK细胞用于治疗血液系统恶性肿瘤，如AML，其安全性和有效性已经得到充分证明。随着临床规模的NK细胞的扩增新方法的不断迭代，新兴的临床试验正在设计中，以评估这些新的模式并扩大它们的适应症。在3例复发或难治性AML患者中进行的CAR NK-92细胞的首个人体临床试验表明，CAR NK-92可以按照每个患者最高达到50亿细胞的剂量进行输注，而不会引起显著的不良反应。使用脐血来源、靶向CD19的CAR-NK细胞治疗复发或难治性CD19+肿瘤患者的I/II期试验也正在进行中。中期结果显示，11名患者中有8名对治疗有明显反应，且没有发生重大毒性反应。表格5总结了NK细胞免疫疗法治疗血液瘤的最新临床试验。



表5：NK细胞免疫疗法治疗血液瘤的最新临床试验

基于 NK 细胞的实体瘤临床试验
同样也有大量的临床试验在评估NK细胞免疫疗法治疗实体肿瘤的安全性和有效性。例如，有一个正在进行的2期临床试验，评估人类HLA半相合造血细胞移植（HCT）后早期移植供体NK细胞（NCT02100891）的安全性和有效性。研究对象是高风险实体瘤患者，包括尤因肉瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤和中枢神经系统肿瘤。还有许多正在进行的临床试验，评估肿瘤靶向的CAR-NK细胞的安全性和有效性，包括使用HER2特异性CAR-NK细胞治疗晚期或转移性HER2表达实体肿瘤（NCT04319757）、ROBO1特异性CAR-NK细胞治疗广谱实体肿瘤（NCT03940820），以及MUC1特异性CAR-pNK治疗MUC1阳性复发或难治性实体瘤患者（NCT02839954）。MUC1特异性CAR-pNK疗法在预防肿瘤复发和移植物抗宿主病方面呈现出良好的安全性和初步疗效。有许多临床试验也在探索NK细胞治疗与其他治疗方法的联合使用的安全性和有效性。评估NK细胞与尼莫珠单抗联合治疗晚期恶性肿瘤的安全性和有效性（NCT03554889）正在进行I/II期临床试验。表格6总结了NK细胞免疫疗法治疗实体瘤的最新临床试验。



表5：NK细胞免疫疗法治疗实体瘤的最新临床试验

总结
NK细胞作为一种特殊的免疫效应细胞群体，配备了快速且强大的抗肿瘤能力。十年前，开创性的临床研究证明了NK细胞癌症免疫治疗的概念，针对的是血液系统恶性肿瘤。NK细胞的来源，并将其在体外的扩增到临床规模，并使回输的NK细胞在体内存活并发挥作用阻碍了NK细胞癌症免疫治疗进展。随着iPSC-NK和基因编辑方法等新工具开发以及对NK细胞生物学的新认识，现在是重新探索NK细胞治疗潜力的时候了。尽管存在挑战，但目前已批准的NK细胞治疗产品和新兴的临床前和临床研究仍然吸引着人们的注意。