病毒TCID50测定（组织半数感染量）

华梦一生

概念：半数感染量（median infective dose，ID50）表示在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。
一、实验目的
了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。
二、测定病毒感染力的方法
半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测
半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测
半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测
蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测
三、材料
1、长满单层的细胞1瓶
2、胰酶、吸球、吸管、生长液
3、96孔细胞培养板
4、加样器、枪头
5、病毒液（PRV）
四、TCID50的操作步骤
1、在青霉素瓶或无菌离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10，即
10-1为100ul加入900ul孵育液中。
2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100l。
3、在每孔加入细胞悬液100l，使细胞量达到2~3×105个/ml。
4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100l生长液+100l细胞悬液）
5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法
【此步操作注意事项】：
1） 建议每个稀释度接种8个孔。
2） 病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。
3） 此过程需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用高压灭菌的枪头，在超净台中打开。
五、TCID50的计算方法
1、Reed-Muench两氏法

病毒液稀释度	出现CPE孔数	无CPE孔数	累计	出现CPE孔所占的%
CPE孔数	无CPE孔数
10-1	8	0	27	0	100（27/27）
10-2	8	0	19	0	100（19/19）
10-3	7	1	11	1	91.6（11/12）
10-4	3	5	4	6	40（4/10）
10-5	1	7	1	13	0.7（1/14）
10-6	0	8	0	21	0（0/21）

CPE：Cytopathic effect
距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）
＝（91.6-50）/（91.6-40）
＝0.8
lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数
=0.8×(-1)+(-3)
=-3.8
TCID50=10-3.8/0.1ml
含义：将该病毒稀释103.8接种100l可使50%的细胞发生病变。
2、Karber法

病毒液稀释度	出现CPE的孔数	出现CPE孔的比率
10-1	8	8/8=1
10-2	8	8/8=1
10-3	7	7/8=0.875
10-4	3	3/8=0.375
10-5	1	1/8=0.125
10-6	0	0/8=0

lgTCID50=L-d(s-0.5)
L：最高稀释度的对数
D：稀释度对数之间的差
S：阳性孔比率总和

lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)/p>=-3.875
TCID50=10-3.875/0.1ml
含义：将该病毒稀释103.875接种100l可使50%的细胞发生病变。
实例  PEDV病毒培养及毒价测定
（一）病毒的制备
将实验室保存的PEDV AJ1102株病毒接种于单层Vero细胞，37℃吸附1h后换维持液，置5% CO2温箱37℃培养；逐日观察，待细胞病变达75%以上，收获病毒悬液冻融，以3000r/min离心10min，取上清液，1mL每管分装，置-80℃保存备用。
（二）检测TCID50
1．TCID50的概念
TCID50为半数细胞培养物感染量，是利用不同稀释度的病毒液接种细胞后，能使培养细胞一半发生细胞病变的病毒量。
2．病毒TCID50的测定
（1）稀释病毒液  将细胞培养的病毒液作10倍递进稀释，即稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。
（2）接种细胞培养板  取适宜稀释度的病毒液分别与培养液按1∶1混合，接种于96孔细胞培养板上。每个稀释度接种4～6孔，每孔100L，同时设立病毒对照和细胞对照组。置37℃ 5%CO2培养箱培养72h。观察记录病变情况。
（3）判断 70%以上的细胞出现CPE判为感染。
3．TCID50计算举例
（1）CPE结果见表
TCID50测定结果  (接种剂量100L)

病毒稀释度	观察结果	累计结果
CPE数	无CPE数	感染%	CPE数	无CPE数	感染%
10-5	5	0	100	11	0	100
10-6	4	1	80	6	1	86
10-7	2	3	40	2	4	33
10-8	0	5	0	0	9	0

（2）计算按Reed和Muench法
TCID50的对数=高于50%病毒稀释度的对数＋距离比例×稀释系数的对数
本例高于50%病毒稀释度的对数为-6，距离比例为0.68，稀释系数的对数为-1。代入上式则：
lgTCID50=（-6）＋0.68×（-1）=-6.64
∴TCID50=10-6.64，100L
即：将病毒悬液作10-6.64稀释后，给细胞培养物接种100L，可以使50%的细胞产生CPE。
（3）结果判断  当细胞培养毒液中病毒的TCID50≥10-6.0方可判为合格。