合成生物学在药物研发中的应用

塞上云烟辣

（自己总结，非专业人士，供学习交流，错误之处还望指出~）
摘要：合成生物学作为21世纪生物学领域颠覆性创新和学科交叉融合的前沿代表，在这二十年来取得了长足发展，并取得了辉煌的成就，有望改变生物技术和医药领域。作为一个本身就诞生于多领域交叉的学科，其应用也是非常广泛，但最主要也是最重要的就是医药领域。在这里，首先对合成生物学各方面进行简单介绍，随后合成生物学在药物研发中的应用做简要总结，主要集中在临床研究前的药物探索和药学研究阶段，涉及到靶点筛选与验证、疾病机制理解、药物发现与筛选、药物生产以及新型治疗和递送方式的内容。合成生物学在这些方面的革新，极大地提高了药物研发的效率，加速了进程，为一系列疾病的治疗带来新的更有效的策略。
Abstract:As the representative frontier of disruptive innovation and interdisciplinary integration of the biological field in the 21st century, synthetic biology has made great progress in the past two decades and made brilliant achievements, which is expected to change biotechnology and medicine. As a discipline born of multi-field intersection, its application is also very extensive, but the main and the most important application is the medical field. Here, after a brief introduction of various aspects of synthetic biology, the application of synthetic biology in drug development is briefly summarized, which mainly focus on the stage of drug exploration and pharmaceutical research before clinical research, involving target screening and validation, disease mechanism understanding, drug discovery and screening, drug production, and new treatment and delivery methods. The innovation of synthetic biology in these aspects has greatly improved the efficiency of drug development, accelerated the process, and brought new and more effective strategies for the treatment of a series of diseases.
1. 合成生物学及药学应用
合成生物学是“后基因组时代”生命科学研究的新兴领域，是继DNA双螺旋结构发现和人类基因组计划后，以基因组设计合成为标志的第三次生物技术革命，为威胁人类生存的各类重大问题的解决提供了新的方案。其本质上是使用与系统生物学相反的自下而上的方法对多种天然的或人工设计的生物学元件进行合理、系统的组装和集成，系统的优化和适配，从而获得符合预期目标的人造生命单元或系统[1]。其核心理念是系统化设计和工程化构建，这就要求使用的生物学元件具有功能专一性、兼容性和普适性，达到即插即用的目的。这种以工程师的视角，基于工程设计的理念进行生物学研究的新兴交叉学科，对于当时细胞和分子生物学来说是非常陌生的。合成生物学发展至今已有二十多年的历史，在范围、期望和产出方面都有了长足的发展，取得了部分重量级成就，并已成为生物学研究的一个广泛认可的分支，具有广阔的前景。



图1 合成生物学简史[2]

合成生物学的一词是在法国科学家Leduc在1911年出版的《生命的机制》一书中首创，但当时的科学家还不能理解生物分子本质，直到DNA双螺旋结构的发现才开启了分子生物学时代。1961年，Francois Jacob和Jacques Monod通过对大肠杆菌中lac操纵子的研究提出了用分子成分组装新的调控系统的设想[2]。随着分子克隆、PCR、DNA测序和计算机技术的发明和进步，开始有不同学科的科学家意识到这个机会，开始转向分子生物学领域进行合作研究（图1）。2000年，Collins团队和Elowitz团队分别设计并成功构建了首个包含启动子的基因开关以及首个能产生蛋白振荡表达的基因振荡电路。这是合成生物学成功的首次案例报道，而Eric Kool将合成生物学重新定义为“基于系统生物学的遗传工程”，标志着这一学科的正式诞生[3]。在随后几年间基因电路上的研究进一步深入，并且超越简单的基因调控网络的细胞-细胞通信电路被开发出来。近年来，合成生物学的规模和范围开始急剧增加，并取得一系列耀眼的成就。例如，Craig Venter自2010年首次化学合成生命“Synthia”之后，又不断进行改进，创造了第三代能像天然细胞一样正常分裂生长的JCVI-syn3A，对阐明基因作用和生命运行机制有重要意义[4]。又如马延和团队通过耦合化学催化和生物催化模块体系，成功构建出从二氧化碳到淀粉合成的路径，大大简化了淀粉人工合成路径并将能量转化效率提高了3.5倍[5]。
药学可以说是合成生物学技术应用最多的领域，从最初药物靶点发现、药物筛选以及后续药效研究等阶段都能产生了巨大的影响，革新了相关技术，提升了效率。合成生物学最直接和最先进的应用，即能够改变生物体代谢以生产高附加值产品，应用范围从生物燃料和植物天然产品到聚合物前体和生物材料[6]。这种将微生物转化为与有机化学合成竞争的化工厂的能力正使我们迎来生物制造的新时代。该优势在复杂天然产物药物上的合成上特别明显，不但省去了复杂繁琐的有机合成步骤，并且能解决产物手性的问题，目前的成果集中在植物来源萜类化合物的生物合成方面，如青蒿素、紫杉醇、番茄红素、银杏内酯等多种药用活性成分[7]。除了药物的合成，在生物医药应用中经常出现的难题是提高药物靶向特异性、精确控制给药剂量、最小化副作用、缩短诊断到治疗时间以及避免病原体的耐药性。由于合成生物学能实现复杂且高精度的生物控制元件与传感和递送机制的有机结合，这门新兴的科学或许能够以新的方式提供新的适合迎接当前生物医学挑战的工具[8]。在开创性的生物合成网络首次报道后，经过廿余载的发展，应用于人类主要疾病的动物模型治疗的成功案例也开始涌现。虽然合成生物学这门学科仍然稚嫩，但已经在药学各个领域掀起颠覆性的技术革命浪潮，且部分技术得到产业化应用，展现出光辉的前景。
2. 合成生物学在药物研发中的应用
药物研发包括多个阶段，一般一款新药的研发流程包括药物探索阶段，药学研究阶段，临床前生物研究阶段，临床研究阶段，以及临床后的审批上市。目前合成生物学的应用主要集中在药物研发的前两个阶段，包括靶点寻找、药物分子合成、制剂开发、毒理学等。接下来将对合成生物学在这两个阶段的应用进行阐述与讨论。
2.1 药物探索阶段
对于新药研发，寻找药物靶点和生物标志物是该阶段应首先确定的问题，确定了药物作用靶点就相当于确定了研究方向。一般而言，药物作用的新靶点一旦被发现，往往会成为一系列新药发现的突破口。合成生物学设备可以用来系统性地研究天然通路中各个成分的功能。James J. Collins的团队设计了模块化的核糖开关，可以用来调节有毒蛋白质或生物网络中任何基因的表达[9]。为了实现对靶基因的转录后控制，核糖体调节因子5’ UTR的mRNA序列被设计成一个发夹结构，该结构能隔离核糖体结合位点（RBS）以阻止核糖体结合。这种cis-mRNA的翻译抑制可以通过一种独立调控的转激活RNA来实现，该转激活RNA以茎环为目标进行展开。工程化的核糖开关已被用于严格调节CcdB的表达（一种抑制DNA旋转酶的毒性细菌蛋白），以更好地理解导致诱导细菌细胞死亡的DNA序列。这项工作为细菌如何对致命刺激做出反应提供了新的见解，并为开发更有效的抗菌疗法开拓了道路。由于精确地修改基因序列的能力，CRISPR-Cas9技术在该领域被广泛应用，催生了具有靶标验证能力的几个新的重要生物元件，它们在选择正确的靶点上具有显著优势。例如，最近的报告包括在原代T细胞中使用CRISPR-Cas9来识别与HIV感染和发病机制相关的因子，而Martufi和Borestrom则使用原代人类成纤维细胞和干细胞衍生的肾细胞来探究与疾病相关的基因[11]。这意味着现在用于验证实验的细胞比以往任何时候都更接近患者细胞。因此，如果可以用药物调节这个靶点，这些研究结果将更有希望转化为临床上的实际效果。此外，CRISPR-Cas9还提供了产生全基因组筛选集的能力。阵列CRISPR库的使用可以很容易确定每个基因在阵列中的作用，并且可以沉默基因功能以快速检查这些基因在不同细胞模型中的作用。



图2 合成生物学在药物探索阶段的应用[10]

合成生物学还能通过构建疾病模型的方式促进对发病机制的理解，这对医学的发展和找到对症的治疗药物至关重要来，最典型的例子便是阿尔兹海默症，像电气工程师在电路印刷成集成电路前在电路试验板上制作电路原型一样，合成生物学对发病机制的探究主要通过利用独立的组件建立合成的通路和系统模型的方式进行，这允许在一个隔离的、特征良好的环境中对子模块进行严格的测试。合成细胞模型的主要应用是在免疫肿瘤学领域。这些模型旨在研究各种细胞表面受体对B细胞抗原受体（BCR）信号通路的调控，以了解B细胞免疫缺陷的病理机制。Harumiya通过将J558L骨髓瘤细胞与蛋白Ca2+指示剂YC3.60相结合重建了这种BCR信号通路。在J558Lμv11细胞中鉴定了100多个BCR诱导的酪氨酸磷酸化蛋白，这与在B细胞中观察到的相似，并发现了一个新的成员，即非受体蛋白酪氨酸激酶Fer[12]。病原病毒基因组同样可以被重建并用于研究传染病大流行的分子基础。例如，对严重获得性呼吸综合征（SARS）冠状病毒和1918年西班牙流感病毒的合成重建有助于确定可能赋予人类趋向性和增强毒性的基因突变[10]。其他疾病模型已用于研究宿主-病原体相互作用、免疫疾病、代谢疾病、神经退行性疾病和癌症等。值得一提的是，合成生命的研究可能能使我们从根源上理解生命运行的机制和发病机理。
在药物筛选方面合成生物学也发挥了重要的作用，大大提升了药物筛选效率，助力药物分子的发现。传统药物筛选通常是采用基于靶点的方法，这种方法的可以通过预定义的药物作用机制启动项目研究，即选择的治疗靶点，可以通过呈现构效关系的化学系列进行验证。但问题是，药物靶点验证过程漫长而反复，如若靶点选择不佳的实验证据出现在在药物开发的后期，将会危及整个项目，前功尽弃。而合成生物学用于药物筛选的策略是将疾病表型纳入基于细胞的检测。在这种情况下，药物可能会改变多个靶点或通路，但我们不做作用机制的假设。借助合成生物学构建一个最小的合成细胞是常用的方法，它应包含对细胞生存和增殖至关重要的基因以及与疾病相关的遗传回路，这与药物开发中基于表型的细胞模型研究策略非常一致[13]。在基因电路中通常会集成发光或荧光报告基因（如GFP）以监测输出信号，即与这些基因调控因子的结合相互作用。到目前为止，这些筛选细胞为基础的分析多被用来识别通过与阻遏物或诱导剂直接相互作用来调节基因表达的小分子。其中，抗结核化合物的筛选是较为成功的例子。在结核分枝杆菌中，乙硫异烟胺可以被Baeyer-Villiger单加氧酶EthA转化为细胞毒性InhA抑制化合物。但因为EthR对EthA的抑制作用导致转化效率较低，治疗效果较差。Martin Fussenegger通过将EthR融合到反式激活子VP16来进行抗结核化合物的筛选，VP16在EthR–VP16与操纵基因OethR结合时激活最小启动子Pmin。当使用该细胞系筛选化合物库时，只有非细胞毒性、细胞渗透性和EthR特异性分子才能特异性抑制SEAP的产生[14]。使用该筛选体系，小分子2-苯基乙基丁酸酯被筛选出来，它不仅满足所有上述标准，还激活了结核分枝杆菌中EthA的表达，使这种病原体对抗生素乙酰胺更敏感，从而为治疗结核病提供了新的治疗选择。近期，Jens Klein首次报道了使用组合遗传学方法在面包酵母中产生的一系列74种新化合物，并基于与靶蛋白“共同进化”的概念实验验证了出20%化合物具有新颖的支架[15]。该方法代表了一种全新的、用于命中和早期先导识别的补充策略，可以很容易地集成到现有的药物发现过程中。此外，合成生物学也为宏基因组学提供更大机遇，可以增加用于挖掘宏基因组学的选择系统的能力，进而将加速功能宏基因组学的速度和输出，并且已经在从土壤、海洋发现天然产物方面取得部分成果[16]。



图3 半合成青蒿素的主要阶段[17]

        合成生物学在药物分子制造方面的成果可能是最成功并最早进入产业化的。虽然药物的发现为治疗疾病提供了基础，但以经济、规模化的方式生产这种药物就需要考虑到技术和成本问题。因此，药物的发现并不总能给最需要药物的人带来希望。虽然大多数小分子可以通过经典的合成化学来解决，但所有上市的小分子药物中有约三分之一是天然产物来源的，需要从天然宿主中分离[18]。尽管借助微生物或真菌实现了抗生素的经济高效生产，但植物次级代谢产物的大规模生产带来了巨大的经济挑战，例如抗疟疾药物青蒿素和抗癌药物紫杉醇。幸运的是，将合成生物学与代谢工程策略相结合用于微生物生产稀有天然产品的技术，使世界各地病人的药物获取成为可能。半合成青蒿素项目主要分为三个阶段：在大肠杆菌中生产无定形二烯、青蒿素酸生物合成和酵母生产、以及青蒿素酸向青蒿素的化学转化（图3）。之所以决定生产青蒿酸而不是双氢青蒿酸，是因为当时负责生产双氢青蒿酸的酶是未知的（随后研究表明为DBR2），并且青蒿素酸向双氢青蒿酸的化学转化相对简单，在工业上可实现。使用该技术工程化的酿酒酵母菌株能使产生青蒿素的产量提升至25 g/L，进而使青蒿素每公斤价格降低到300美元以下[17]。另一个例子是紫杉醇，紫杉醇是一种三环二萜类化合物，首次从短叶红豆杉树皮中分离出来。它是迄今为止发现的最有效的天然抗癌药物之一，已广泛用于治疗乳腺癌、卵巢癌、肺癌以及其他疾病。然而，紫杉醇在红豆杉树皮中的含量极低，因此迫切需要开发替代来源以满足临床需求[19]。利用合成生物学的方法来实现紫杉醇相关基因在微生物宿主中的异源表达可能是一个很好的选择。尽管在紫杉醇生物合成方面做了许多杰出的工作，但最高的产量是1 g/L的紫杉二烯产量。这种生产远远没有达到工业经济生产的最低标准，紫杉醇的半合成仍是目前唯一可行的商业方法。因此，有必要从红豆杉或其他生物中找到最适合合成紫杉醇的途径和最适合的基因，这仍需要大量的工作。
除了最初的新药发现、筛选、合成阶段，合成生物学也对药物药物制剂领域产生了重大影响，革新了药物递送技术和治疗方式。目前广泛采用的给药途径通常对健康组织有较强的毒副作用。基于合成生物学方法开发的递送技术能使药物递送以程序化的形式进行，在检测到病理状态时释放正确剂量的药物。具体例子包括能在胃肠道中释放疾病特异性药物的口服给药的工程细菌，以及由可移植的微囊化哺乳动物细胞组成的假体装置，其配备有合成基因电路或组装的信号通路，可用于恢复代谢疾病中的化学稳态。目前这种基于细菌和细胞的疗法在肿瘤方面的应用较广泛。CAR-T细胞疗法通过重编程人体自身的免疫系统以捕捉和摧毁癌细胞，取得了巨大成功。合成生物学可以进一步增强CAR-T细胞的特殊性和时间性。近日，Wendell A. Lim就设计了肿瘤特异性synNotch受体电路并将其导入CAR-T细胞，使其具有局部诱导产生细胞因子IL-2的能力，成功克服了肿瘤微环境的免疫抑制[20]。这些电路有效地增强了CAR-T细胞浸润和免疫抗性肿瘤的清除，而无全身毒性。最有效的IL-2诱导电路以自分泌和T细胞受体（TCR）或CAR独立的方式起作用，绕过消耗IL-2或抑制TCR信号的免疫抑制机制。而肿瘤细菌疗法依赖自然界中细菌的毒力、自主运动能力以及对肿瘤的趋向性和侵袭能力等特征，使细菌具有调节肿瘤免疫微环境、诱导抗肿瘤免疫反应的能力。例如，在上世纪六十年代，为了治疗哮喘性支气管炎及预防结核病和结核性脑膜炎的卡介苗就被用于肿瘤治疗的研究，并被证明能激活肿瘤免疫，且已通过审批进入临床[21]。Kwan Man就利用氧气敏感启动子元件设计了一套基于“自杀开关”的合成生物学基因线路，构建了一株仅能在瘤内定植的专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌 YB1。该菌株中需氧启动子PsodA对厌氧启动子PpepT的本底表达具有抑制作用，不仅能精确调控细菌生理行为，避免了逃逸，而且瘤内的定植数量要显著高于正常组织器官内的数量，实现了较好的肿瘤治疗效果[22] 。此外，研究人员还设计噬菌体对抗致病菌感染。Jim Collins设计并构建了表达放线菌衍生的放线菌分散体B（DspB）的T7衍生的噬菌体，DspB能水解β-1,6-N-乙酰基-D-葡萄糖胺，这是葡萄球菌和大肠杆菌中生物膜形成和完整性所需的关键胞外聚合物质（EPS）。向大肠杆菌生物膜施用工程化噬菌体后，最初只感染少数细菌，产生胞内子代噬菌体和DspB，随后通过细胞裂解释放这两种化合物。释放的DspB通过降解EPS来降解生物膜结构，释放的噬菌体攻击邻近细胞，从而重新启动抗菌循环，最终实现优异的抗菌效果。结果表明，DspB工程化噬菌体的应用使细菌生物膜细胞数减少了4.5个数量级，比野生型对照噬菌体高约2个数量级。这表明，工程噬菌体可能成为环境、工业和临床环境中生物膜控制的可行选择[18]。
2.2 临床前研究阶段



图4 应用于毒理学问题的合成生物学设备[23]

在合成生物学策略的协助下，监测药物的药效学、药代动力学和毒性正在达到新的灵敏度和效率标准，工程DNA纳米结构也用于监测体内药物代谢。揭示在生物网络中诱导毒性通路的成分是临床前阶段药物毒性研究的重要组成部分。基于细胞的毒性剂量反应评估依赖于对毒性通路扰动的小的细胞信号的检测。Zhang等人开发了遗传回路，如积分反馈、正反馈和跨临界分岔，以在响应某些特定细胞状态的变化时获得可接受的阈值，如活性氧物种、氧分子水平、DNA损伤、蛋白质折叠、金属离子或渗透压[13]。药物的毒性也可能成为工程底盘生物的一个问题，主要体现在生产效价的限制。为了减少毒性影响，已经提出了基于细胞中工程输出系统的合成生物学方法。基因响应电路有许多用于筛选化学品毒性影响的简单响应电路的现有示例。这些可以通过简单的范例来理解，该范例将一些输入（如特定化学物质的存在）通过传感器和换能器连接到输出（如报告蛋白的表达）（图4）。多年来，重组报告基因分析一直被用于预测新的化学实体诱导P450表达的潜力，因为这可以改变共同给药药物的代谢，从而导致不良药物相互作用。这些测定通常将目标基因（通常是P450）的上游调控序列与一些容易检测到的报告蛋白（例如荧光蛋白）联系起来。在适当的宿主细胞中筛选配体，以改变核受体/转录因子与调节元件的结合，从而影响报告基因的表达[23]。与药物开发一样，这一概念也被应用于环境监测。水生环境中多环芳烃和相关污染物的存在可以通过鱼类中P450的诱导来评估。因此，已经开发出了一种转基因斑马鱼，其中GFP表达受CYP1A1启动子调控，允许检测多氯联苯。
3. 总结与展望
合成生物学对药物研发产生了非常重要的革命性的影响，从药物的发现、生产到制剂和药效评估。随着DNA合成技术的进一步成熟，其成本将再次降低。对基因组、基因组编排和基因调控的日益深入了解，以及底盘生物的可用性提高，都将促进未来取得的更大的成功。借助于CRISPR技术的优化，合成生物学构建的基因回路在靶点识别和验证上将更加精准、快速和高通量。基因组序列的可用性、数据科学和合成生物学的结合使基因组挖掘得以实现，这可能会催化天然产物药物发现的复兴。而合成生物学对各种细胞疗法的推动也是不言而喻的，细胞被工程化用于各种功能，且随着生物元件性能的提升将有更好的效果。最后，人工智能和机器学习等现代技术与合成生物学和化学之间的工作流程的融合，将进一步推动药物发现的边界。合成生物学在药物研发上的应用前景一片光明，贡献意义巨大。
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