易混淆的生物学知识12-蛋白标签相关

宁郎

• GST pull Down 与CO-IP的区别
  GST pull down和CO-IP（Co-immunoprecipitation）都是蛋白质相互作用的实验方法，但是它们的原理和应用场景略有不同。
  GST pull down是一种用于检测蛋白质相互作用的体外技术。该方法利用GST（谷胱甘肽S-转移酶）标记的蛋白质结合纯化的靶蛋白，然后用洗涤剂去除未结合的蛋白质。通过SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）和免疫印迹等方法检测结合的靶蛋白。这种方法的优点是简单、快速、适用于大规模筛选和鉴定蛋白质相互作用。
  CO-IP是一种用于检测蛋白质相互作用的体内技术。该方法通过使用抗体特异性地沉淀一个靶蛋白，然后检测与其相互作用的其他蛋白质。CO-IP方法可以检测较弱的蛋白质相互作用，并可以在细胞或组织水平上研究蛋白质的相互作用。CO-IP的缺点是比较繁琐，需要使用适当的抗体和对实验条件进行优化。
  因此，GST pull down和CO-IP两种方法的选择应根据实验的具体目的和所需的检测灵敏度来确定。如果需要快速、大规模地筛选蛋白质相互作用，可以选择GST pull down；如果需要研究蛋白质在体内的相互作用，可以选择CO-IP。
  
• 为什么还区分体外和体内？
  区分体外和体内实验的原因在于这两种实验方法所研究的对象不同。
  体外实验通常是指在离体条件下，即在细胞外环境中进行的实验。这种实验方法的优点在于可以控制环境条件和添加试剂的浓度，便于研究蛋白质之间的相互作用。因此，体外实验通常用于研究蛋白质结构、功能以及相互作用等方面的问题。
  体内实验则是在细胞或组织水平下进行的实验，通常用于研究蛋白质在生物体内的生理功能和相互作用。相对于体外实验，体内实验更能反映生物体内的真实情况。例如，CO-IP实验就是一种常用的体内实验方法，用于研究细胞中蛋白质之间的相互作用。
  因此，根据实验的目的和需要，我们需要选择合适的实验方法，体外实验和体内实验各有其优缺点。同时，体外实验和体内实验也可以相互印证，以更全面地研究蛋白质的结构、功能以及相互作用等方面的问题。
  
• 蛋白质标签有哪些，且该如何选择？
  蛋白质标签是一种在蛋白质上引入特定肽段或蛋白质结构，以方便蛋白质的纯化、检测和功能研究的方法。常用的蛋白质标签包括：
  His标签：由6-10个组氨酸残基组成的亲铜螯合基序列。这种标签能够与金属离子亲和力很强，通常用于纯化His标签蛋白。
  GST标签：由谷胱甘肽S-转移酶（GST）蛋白的C端组成的标签，通常用于纯化GST标签蛋白或与GST标签蛋白相互作用的蛋白。
  FLAG标签：由DYKDDDDK肽序列组成的标签，通常用于检测和纯化FLAG标签蛋白。
  Myc标签：由EQKLISEEDL肽序列组成的标签，通常用于检测和纯化Myc标签蛋白。
  HA标签：由YPYDVPDYA肽序列组成的标签，通常用于检测和纯化HA标签蛋白。
  选择蛋白质标签应该根据实验的具体需要来决定。例如，如果需要在细胞中检测蛋白质的表达和定位，则可以使用FLAG、Myc、HA等标签进行检测；如果需要对蛋白质进行纯化，则可以使用His、GST等标签进行纯化。在选择标签时，还需要考虑标签的大小、抗体的可用性、重组蛋白的稳定性等因素，以便进行更有效的实验设计。
  
• 如何知道我选的标签会不会导致我的目的蛋白不正确折叠?
  选择标签时，确保标签序列不会对蛋白质的结构和功能产生负面影响是非常重要的。以下是一些可能会导致蛋白质不正确折叠的标签设计问题：
  标签的大小：标签的大小对蛋白质的折叠和稳定性有很大的影响。过大的标签可能会妨碍蛋白质的正常折叠和稳定性，因此需要选择适当大小的标签。
  标签的位置：标签应该放置在蛋白质的表面或可容忍的区域，以最小化标签对蛋白质的影响。如果标签放置在蛋白质的重要结构域或活性位点上，可能会影响蛋白质的结构和功能。
  标签的序列：标签序列中的氨基酸残基不应该干扰蛋白质的正常结构和功能。一些氨基酸残基，如Pro、Gly、Asp等，可能会对蛋白质的结构和功能产生负面影响。
  因此，在选择标签时，需要对蛋白质的结构和功能有足够的了解，并且需要对不同标签的设计进行评估和比较。此外，可以使用生物信息学工具来预测标签序列对蛋白质的影响，例如通过蛋白质结构预测软件进行分析和预测。最好的方法是进行实验验证，确保所选择的标签对目的蛋白没有不利影响。
  
• 有哪些网站可以提供此预测呢？提供一下
  以下是一些常用的蛋白质标签预测工具和数据库：
  Protter：http://wlab.ethz.ch/protter/start/
  Protter是一个在线的蛋白质标签预测工具，可以预测标签对蛋白质结构和功能的影响，并显示标签的位置和序列信息。此外，Protter还提供了蛋白质结构注释和可视化的功能。
  Protparam：https://web.expasy.org/protparam/
  Protparam是一个在线的蛋白质理化性质预测工具，可以预测蛋白质的氨基酸组成、分子量、等电点、疏水性等信息，并根据序列特征提供标签的建议。
  ExPASy：https://web.expasy.org/
  ExPASy是一个综合的生物信息学资源平台，提供了多种生物信息学工具和数据库，包括蛋白质标签预测、序列分析、结构预测等功能。其中，ProtScale、ProtParam、ProtScale等工具可以用来预测标签序列的物理化学性质。
  SMART：http://smart.embl-heidelberg.de/
  SMART是一个蛋白质结构和功能注释数据库，提供了蛋白质序列中功能区域和结构域的预测。可以用来确定标签放置的最佳位置，以及标签序列中可能影响蛋白质结构和功能的区域。
  这些工具和数据库都可以在网上免费使用，但需要注意不同工具的预测精度和适用范围。最好的方法是结合不同工具的结果进行综合评估，以确保所选标签对目的蛋白没有负面影响。
  
• 哪些蛋白标签可以在后期蛋白纯化之后去除掉？
  

一些可去除的蛋白质标签包括：
蛋白A标签（Protein A tag）：蛋白A标签可以与IgG结合，并且在碱性条件下可以被洗脱。因此，在纯化IgG的过程中使用蛋白A标签，可以通过调整pH值来去除蛋白A标签。
GST标签（glutathione S-transferase tag）：GST标签可以与谷胱甘肽结合，并且可以使用还原剂如DTT来剪断这个结合。因此，在纯化目的蛋白后，使用还原剂可以去除GST标签。
His标签（histidine tag）：His标签可以结合到金属离子上，通常使用Ni-NTA亲和层析柱来纯化His标签蛋白。在纯化完成后，可以使用EDTA等金属离子螯合剂来去除His标签。
MBP标签（maltose binding protein tag）：MBP标签可以结合到麦芽糖结构上。在纯化完成后，可以使用麦芽糖来去除MBP标签。
需要注意的是，去除蛋白质标签的方法必须不会对目的蛋白造成损伤或影响其结构和功能。此外，需要确保去除标签后的纯度和活性仍然符合实验要求。因此，在去除蛋白质标签前，需要进行一定的优化和验证。