《临床分子生物学检验技术》——核酸实时定量检测

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今天我们将来讲述核酸实时定量检验技术的原理以及相关设计
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• 定义与优点
  

• 实时荧光定量PCR技术：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR反应进程，最后通过相关数据分析方法对目的基因进行定量分析的技术
  
• 优点：1）操作方便、快速、高效 2）在全封闭的体系中完成扩增并进行实时分析，降低污染的可能性 3）可设计不同的引物在同一反应体系中对多个靶基因分子进行扩增，即多重扩增
  

常用概念

• 扩增曲线——是指在实时荧光PCR扩增过程中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的检测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到荧光信号的变化能够绘制成一条以循环数为横坐标，PCR反应过程中荧光强度为纵坐标所作的曲线
  
• 荧光阈值——是指在实时荧光定量PCR扩增曲线上人为设定一个值，他可以设定在指数扩增阶段的任意位置
  
• 循环数——循环数即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定荧光阈值所经过的循环次数。每个模板Ct值与该模板的起始拷贝数成反比关系。起始模板量越高，Ct值越低，Ct值越大，则起始模板量越低
  
• 扩增效率——是指PCR反应一个循环后的产物增加量与这个循环模板量的比值
  

PCR扩增曲线图

实时荧光定量PCR中的荧光物质

• 目前的实时荧光定量PCR技术主要分为：1）荧光染料技术 2）荧光探针技术
  
  
  
  • 荧光染料技术——SYBR GreenⅠ
    
    
    
    • 原理：此染料可以非特异性的结合双链DNA的小沟，但不结合单链。在PCR反应体系中加入过量的染料，游离的过量染料不会产生荧光信号，但当染料掺入双链DNA分子中，则会产生较强的荧光信号。在PCR的过程中，由于新合成的双链数目不断增加，染料与DNA双链结合也越来越多，其荧光信号也越来越强。
      
    
    
  • 荧光探针技术
    
    
    
    • 水解探针技术——以TaqMan探针为代表，因此也成为TaqMan技术。反应体系除了需要一对引物外，还需要一条荧光素标记的探针。探针的5端标记荧光报告基因R，3端标记荧光淬灭基因Q。根据荧光共振能量传递原理，距离很近而使R基因发射的荧光被Q基因所淬灭。随着扩增的进行，Taq DNA聚合酶沿着模板移动合成新链，同时将探针5端逐个水解脱氧核苷三磷酸，R基因和Q基因随之分离，仪器也就能够检测到R基团所发出的荧光
      
    • 双杂交探针——除了需要一对引物外，还需要设计两条荧光标记的探针。第一条探针是探针的3端标记供体荧光基团。第二条探针的5端标记受体荧光基团，此探针的3端必须被封闭，避免DNA聚合酶以其作为引物启动DNA的合成。在PCR扩增的过程中，两条探针与目的基因同时杂交，供体荧光基团与受体荧光基团相互靠近。外来光源首先刺激供体荧光基因，供体荧光基因而后发光刺激受体荧光基因，后者发射出的另一种波长的信号被检测系统检测到。
      
    
    
  
  

双杂交探针示意图

• 分子信标技术
  
  
  
  • 原理：是基于FRET（荧光共振能量转移）原理与碱基互补原理而建立的技术。分子信标实际上是一段荧光素标记的寡核苷酸，由环状区和柄区组成，5端标记荧光报告基因，3端标记荧光淬灭基因。当没有目标序列存在时，分子信标为茎环结构，报告基因和淬灭基因十分靠近因此发生FRET，报告基因所发出的荧光以热形式散发，没有荧光信号。有目的序列存在时，分子信标与靶序列相结合，分子信标结构发生变化，荧光基因与淬灭基因分开，能够检测到荧光信号。
    
  
  

实时荧光定量PCR测定数据分析

• 绝对定量
  
  
  
  • 实时荧光定量 PCR中，模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。即模板起始拷贝数目越大，Ct值越小。利用已知含量的标准品稀释成不同浓度的样本，并作为模板进行PCR的扩增，并得出标准曲线
    
  
  
• 相对定量
  
  
  
  • 一些情况下，不需要对靶基因含量进行绝对定量，只需要分析目的基因的相对表达差异。相对定量就是通过检测靶基因相对于内参基因的表达变化来实现的。
    
  • 内参基因：是指机体各组织和细胞中，一些基因表达相对恒定，在检测其他基因的表达水平变化时常用其作为内部参照物。常用的内参基因包括GAPDH、β-actin、rRNA
    
  
  

<hr/>到此我们就讲解了关于实时荧光定量PCR的部分知识点，还有部分的注意点和详细的计算方法我们会在后期进行补充