Nature | R-环衍生的RNA-DNA杂交体激活免疫应答

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原创 夏天 图灵基因 2023-01-02 09:47 发表于江苏
收录于合集#前沿分子生物学机制




撰文：夏天
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本项研究将R-环与先天免疫激活联系起来作为独特的病理反应，并将细胞质RNA-DNA杂交体作为IRF3信号传递的驱动因素。当RNA-DNA杂交体在细胞质内异常高水平积累时，可以诱导细胞凋亡，不同与典型的DNA损伤机制。




近日美国斯坦福大学化学与系统生物学系的Magdalena P. Crossley等人在《nature》杂志上发表了名为“R-loop-derived cytoplasmic RNA–DNA hybrids activate an immune response”的研究文章。在这篇文章中，作者描述了在细胞质中新发现的一种RNA-DNA杂交体，它们作为R-环处理产物，在细胞质产生、异常积累后可作为免疫原性物种激活IRF3信号传递，并诱导细胞凋亡。在许多疾病，如神经退行性变和癌症中，都观察到了异常的R-环加工和随后的先天免疫激活现象。





R-环是在转录过程中形成的三链核酸结构。异常的R-环形成会干扰DNA的复制和转录，并与多种疾病状态下双链DNA断裂的形成、基因组不稳定、衰老和细胞死亡有关。许多因素抑制了细胞中R-环的形成，如解旋酶SETX，它可以解开R-环的RNA-DNA杂交部分，以及乳腺癌易感基因BRCA1，它参与了DNA修复、复制和转录。虽然已知DNA断裂是由R-环的核内溶解过程导致的，但这些被溶解的核酸的结局及其对细胞的影响仍不清楚。

细胞质RNA-DNA杂交体积累




R-环分解因子的缺失导致XPG依赖的细胞质RNA-DNA杂交体积累。为了研究R-loop的加工，研究者使用重组、GFP标记、无催化活性的RNaseH1D210N（GFP-dRH）来可视化整个细胞的RNA-DNA杂交。siRNA介导的SETX或BRCA1缺失，增加了细胞质GFP-dRH信号，这表明了RNA-DNA杂交体在细胞质中的积累。通过细胞质DNA-RNA杂交免疫沉淀（cytoDRIP）法观察到，去除SETX或BRCA1以及使用PlaB抑制剪接，可以导致细胞质RNA-DNA杂交体的积累增加。通过siRNA介导的XPG或XPF缺失可以消除细胞质RNA-DNA杂交积累。这些结果表明，R-环的切除导致了XPG-和XPF依赖的细胞质RNA-DNA形成的增加。研究者在凋亡缺陷的BAX/BAK/双敲除细胞中仍观察到R环诱导的XPG依赖的细胞质杂交体的积累，表明杂交体不是通过核膜的分解简单地释放到细胞质中。R-环切除导致RNA-DNA杂交体的快速形成和主动输出到细胞质中，并最终从细胞质中被清除。

杂交体起源和稳定性





CycyoDRIP-seq显示，细胞质RNA-DNA杂交体来自于核R-环的一个子集。研究者将cytoDRIP与链特异性RNA-DNA杂交测序（cytoDRIP-seq）相结合，使用对照和SETX耗尽的细胞追踪细胞质RNA-DNA杂交体的起源。细胞DRIP位点同时定位于基因区域和基因间区域。在基因内，大多数cytoDRIP位点发生在基因体内，在基因间区域内，在增强子附近显著富集。接下来，论证基因组杂交体的稳定性是否会影响细胞质杂交体的积累。研究者从测试的cytoDRIP-seq位点估计了R-环的半衰期为43-67 min，表明这些R-环在基因组上的寿命特别长。体外RNase H滴定结合高分辨率核DRIP-qPCR证实，细胞质杂交体定位于核R-环区域，这些区域对RNase H的敏感性较低，需要更长时间的处理才能降解。所述研究结果表明，SETX缺失后观察到的细胞质杂交来自于一小部分核R-环区域，这些区域部分具有RNase H抗性，寿命相对较长，可能是核苷酸倾斜位点的收敛转录的结果。

激活的先天免疫应答




细胞质内核酸可以通过模式识别受体（PRRs）来刺激免疫应答，而R-环的消除与这种信号传递有关。研究发现，SETX或BRCA1，以及PlaB处理的缺失，触发了IRF3在Ser386位点的磷酸化水平（pIRF3）的增加，这是IRF3免疫信号传递的标记物。通过siRNA去除XPG或XPF，或使用aid标记的XPG逆转了这种信号传递。这些观察结果将IRF3信号传递与核R-环消除结合起来。重要的是，在BAX/BAK/细胞中也观察到R-loop诱导的、XPG-和XPF依赖的IRF3信号通路。这些结果表明，先天免疫反应可由不依赖于细胞凋亡的R-环消除触发。为了确定细胞质RNA-DNA杂交是否能直接激活SETX-和BRCA1缺失细胞的免疫反应，我们在这些细胞中稳定表达了细胞质定位的RNaseH（RH-NES）。当RH-NES表达时，细胞质杂交体被有效消除，先天免疫信号通路和细胞凋亡的减少。研究结果表明，细胞质RNA-DNA杂交体直接有助于这些细胞的激活和凋亡。

cGAS和TLR3检测细胞质杂交体




为了检测当R-环被诱导时，哪一种先天免疫传感器介导了IRF3的激活，研究敲除了TLR3、RIGI或MDA5，或抑制cGAS。在SETX缺失的细胞中。抑制cGAS、去除TLR3或敲除cGAS和TLR3降低了pIRF3和下游效应子。同样，在SETX/BRCA1缺失的细胞中，cGAS和TLR3抑制完全抑制了IRF3下游效应因子的激活和细胞凋亡。这些观察结果表明，R-环诱导的IRF3信号通路主要是由cGAS和TLR3介导的。研究者接下来试图阐明cGAS和TLR3是否能识别SETX缺失细胞中的细胞质RNA-DNA杂交体。与之前的报道一致，cGAS依赖的IRF3信号通路可以被合成的RNA-DNA杂交体激活。RNA-DNA杂交体也诱导了TLR3依赖的IRF3信号转导。TLR3和cGAS也分别在体外直接与RNA-DNA杂交体结合。这些结果表明，cGAS和TLR3可以直接识别内源性的、R-环衍生的细胞质RNA-DNA杂交体。

作者总结道：本项研究将R-环与先天免疫激活联系起来作为独特的病理反应，并将细胞质RNA-DNA杂交体作为IRF3信号传递的驱动因素。当RNA-DNA杂交体在细胞质内异常高水平积累时，可以以不同与典型的DNA损伤机制诱导细胞凋亡。

教授介绍




Magdalena P. Crossley教授，现任职于美国斯坦福大学化学与系统生物学系，主要从事生物工程学、合成生物学、基因编辑和细胞治疗方向的研究。e-mail: [email protected]
参考文献
Crossley, M.P., Song, C., Bocek, M.J.et al. R-loop-derived cytoplasmic RNA–DNA hybrids activate an immune response. Nature (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05545-9

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