张锋及刘如谦参与创办，CRISPR育种新贵首款产品或于明年 ...

李中文1

CRISPR 被称为 “基因的剪刀”，于 1987 年被首次描述，其自然生物学功能最初在 2010 年和 2011 年被报道。其应用广泛，包括基础生物学研究、生物技术产品的开发、疾病的治疗等。

CRISPR 基因组编辑工具由一个小 RNA （引导 RNA）和核酸内切酶 Cas 共同组成 CRISPR-Cas 系统，它们可以共同定位、结合和切割复杂基因组中的特定序列。现在许多版本的 CRISPR 编辑工具可以以不同的方式修改靶标，包括序列插入、删除和特定的碱基更改。

应用最广泛的 CRISPR-Cas9 系统，于 2013 年首次分别由麻省理工学院教授、麻省理工学院和哈佛大学博德研究所研究员张锋和哈佛大学遗传学教授 George Church 报道了其在哺乳动物基因组编辑中的作用。2015 年，张锋团队在 Cell 期刊发表的论文“Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System”描述了新开发的 CRISPR-Cas12a（当时称为CRISPR-Cpf1）。

过去的 10 年中，研究人员对 CRISPR 进行了多种改进与应用。迄今为止，最突出的应用是医疗，例如镰状细胞性贫血疗法。张锋也是多家生物技术和治疗公司的创始人或联合创始人，包括 Sherlock Biosciences、Arbor Biotechnologies、Editas Medicine、Beam Therapeutics 和 Pairwise。后三家的联合创始人刘如谦则是碱基编辑技术的开创者，该技术能够在特定点以高精度和高效率对单个碱基对进行编辑，且不依赖 DNA 双链断裂，因此被认为比 CRISPR-Cas9 具有更高的安全性。刘如谦是博德研究所的副主任，他所创立的其他公司包括 Prime Medicine、Exo Therapeutics、Chroma Medicine 和 Resonance Medicine。

随着基于 CRISPR 的疗法陆续通过临床试验取得成功，该工具也在对全球农业至关重要的农作物上取得了重大进展。

在张锋、刘如谦创立的一众公司中，Pairwise 深耕农业，利用其独特的基因编辑技术改造作物性状，在农产品市场开辟全新领域——改良的水果和蔬菜新品种。新型果蔬将变得口感更好、食用更方便、保质期更长、产量更高，采摘也更容易，采摘季更长。



首款产品预计将于明年线下销售


Pairwise 总部位于美国北卡罗来纳州，由其首席执行官 Tom Adams （曾担任孟山都全球生物技术副总裁，拥有超过 25 年全球公司生物技术领导经验）博士和首席商务官 Haven Baker 博士创立，除刘如谦、张锋外，其他联合创始人还包括来自麻省总医院（MGH）的 Keith Joung 博士。该公司的基因编辑技术由 MGH 及博德研究所授权。

富含水果和蔬菜的饮食可以帮助降低患心脏病、II 型糖尿病、某些癌症和肥胖症的风险。然而据来自美国疾病预防控制中心的数据，目前仅有 10% 的美国人能达到推荐的每日果蔬摄入量标准。在食品科技如火如荼的今天，只有区区 3% 的新食品是水果和蔬菜。

毋庸置疑，Pairwise 所做的，在全球气候变化、人口增长、资源紧俏、流行性疾病爆发的背景下，对于粮食和营养安全、供应链、食品浪费等等方面，显得格外重要。正如 Tom Adams 所言，“人们每天都会看到身边有很多创新，但农产品行业却是个例外。我们将为果蔬消费者提供新的选择，让健康饮食变得更简单、更令人兴奋。”

Pairwise 因此受到农业巨头与相关投资者的青睐。2021 年，Pairwise 完成 9000 万美元 B 轮融资，由 Pontifax 全球食品和农业技术基金（Pontifax AgTech）、现有投资者 Deerfield Management Company 领投，淡马锡（Temasek）和现有投资者拜耳（Leaps by Bayer）参投。2018年，Pairwise 获得 2500 万美元 A 轮融资，由 Deerfield 和 Leaps by Bayer 领投，用于开发其基因编辑平台和首期产品组合。

在今年旧金山举行的未来食品会议上，Pairwise 推出了品牌 Conscious Foods，第一款产品将是名为 Conscious Greens 的绿叶沙拉蔬菜，预计将于 2023 年以包装沙拉的形式线下销售。经基因编辑而去除刺激性气味的芥菜（Brassica juncea），是这款产品的亮点。近日，Pairwise 团队在 Plants 上发表的研究论文“Targeted Mutagenesis of the Multicopy Myrosinase Gene Family in Allotetraploid Brassica juncea Reduces Pungency in Fresh Leaves across Environments”，报道了如何通过 CRISPR-Cas12a 实现这一成果。

根据美国农业部 （USDA） 的数据，100 克芥菜可以提供大量的重要营养元素，包括每日所需的 215% 维生素 K、78% 维生素、17% 维生素 A 和 11% 纤维。尽管已经种植了数千年，并且是绿叶蔬菜中最富营养的植物之一，但由于异硫氰酸烯丙酯的辛辣味道，芥菜通常在腌制或烹饪后食用，营养价值大打折扣。要想吃营养保留最多的新鲜芥菜，离不开适口性的提高。

异硫氰酸烯丙酯是在黑芥子酶与硫代葡萄糖苷（sinigrin）的作用下产生的。Pairwise 使用 CRISPR-Cas12a 工具关闭了编码黑芥子酶的基因。

芥菜是异源四倍体，意味着每条染色体有 4 个“版本”，大多数基因存在于多个拷贝中。其黑芥子酶基因在整个基因组中有 17 个。因此，要同时关闭所有黑芥子酶基因，需要一个非常有效的编辑器。

Cas12a 系统在几个重要方面与先前发现的 Cas9 不同，对研究、治疗以及商业和知识产权具有重大影响。

首先，在其天然形式中，DNA 切割酶 Cas9 与两个小 RNA 形成复合物，这两个 RNA 都是切割活性所必需的。Cas12a 系统更简单，因为它只需要一个 RNA。Cas12a 酶也比标准 SpCas9 小，使其更容易递送到细胞和组织中。

其次，也许也是最重要的一点，Cas12a 以与 Cas9 不同的方式切割 DNA。当 Cas9 复合物切割 DNA 时，它会在同一位置切割两条链，留下“钝端”，这些末端在重新连接时经常发生突变。而对于 Cas12a 复合物，两股中的切口被抵消，在暴露的末端留下短悬垂。 这有望帮助精确插入，使研究人员能够更高效、更准确地整合一段 DNA。

第三，Cas12a 切割远离识别位点，这意味着即使目标基因在切割位点发生突变，它仍然可能被重新切割，从而允许发生多次正确编辑的机会。

第四，Cas12a 系统为选择目标位点提供了新的灵活性。与 Cas9 一样，Cas12a 复合物必须首先连接到称为 PAM 的短序列上，并且必须选择与天然存在的 PAM 序列相邻的靶标。Cas12a 复合物识别的 PAM 序列与 Cas9 所识别的非常不同。这可能是靶向某些基因组的优势，例如疟疾寄生虫和人类。

对于芥菜，Pairwise 与 Cas12a 蛋白一起，表达了 7 种不同的引导 RNA，每种 RNA 靶向一个或多个黑芥子酶基因中的一个序列。为了将表达 CRISPR 的基因递送到芥菜幼苗中，使用了根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。接下来，从这些表达 Cas12a 基因的单个植物细胞中再生了整株植物，并鉴定了一些具有非刺激性叶子的植物，表明这些植物缺乏黑芥子酶活性。



Pairwise 还开发了一种生化测定法来测量葡萄糖的释放量，以定量比较叶片中黑芥子酶的活性。葡萄糖是硫代葡萄糖苷水解为异硫氰酸烯丙酯的副产物。该定量测定证实了风味测试的结果。

减数分裂遗传的一个特征是染色体分离，育种者几千年来一直通过这一原理选择新一代重新“洗牌”过后的最佳性状组合。Pairwise 使用这种策略从第二代中选择了遗传了被编辑过的无黑芥子酶基因功能的植物，且同时不存在 CRISPR 基因，这种植物成为 Pairwise 产品线的基础。

鉴定出具有目标基因组合的植物后，Pairwise 花了 3 年时间系统地测试了多代群体的风味、外观、保质期和产量等性能。正在进行的工作为芥菜叶子性状的优化，以改善口感和外观。

已与拜耳达成 1 亿美元合作


Pairwise 改造的另一种蔬果是黑莓。目的是通过基因编辑摆脱令大多数消费者“讨厌”的种子以及缩短其生长周期。同时，Pairwise 正在与拜耳进行价值 1 亿美元的合作项目，以推进玉米、大豆、小麦、油菜和棉花中的基因编辑工具，并已取得了可观的进展——开发了相关工具来解决一些普遍存在的难题，包括作物产量、病虫害、天气等环境胁迫、以及能够让这些行栽作物长期可持续增长的其他关键因素。

与需要插入外源基因的转基因食品不同，CRISPR 只是编辑植物自身的 DNA 以增强某些性状。美国农业部表示“CRISPR 食品不需要像转基因食品那样进行监管”。这无疑为初创公司打开了进入该领域的大门。CRISPR 技术的两大专利持有者博德研究所和杜邦先锋，也在为初创公司提供帮助，允许公司使用非排他性的 CRISPR 许可证，收取预付费用和年度销售特许权使用费。以下列举了一些在该领域的公司或研究机构。



估值达 12 亿美元的 Inari 利用 CRISPR 开发了一个作物育种平台 SEEDesign，该平台使用预测设计，通过 AI 深入了解基因，从而在单个基因组中进行多次编辑，以达到增产的目的。Inari 称，这种方式可以将植物育种时间（10-15 年）缩短三分之二，成本降低多达 90%。与此类似，TreeCo 正在用这种方式缩短林木育种时间，同时改善许多其他所需的性状，例如气候适应性，以及作为生物燃料、塑料替代品、纺织品和纸张的材料性状。

其他通过 CRISPR 改进作物的公司还包括：Yield 10 Bioscience 正在开发具有较高 Omega-3 脂肪酸含量的亚麻籽；Cibus 开发了对常用除草剂具有抗性的油菜；Calyxt 编辑出生产耐热油而不产生反式脂肪的大豆，以及低麸质小麦和高纤维马铃薯；Tropic Biosciences 正在开发对黑条叶斑病和巴拿马病更具抗性的香蕉品种；纽约的 Cold Spring Harbor Laboratory 投入巨资开发更容易收获和运输的“无花梗”西红柿；由 CRISPR-Cas9 的共同发现者 Jennifer Doudna 于 2014 年创立的加州大学伯克利分校创新遗传学研究所（IGI）正在开发对病毒和真菌具有更强的抵抗力的可可。

值得一提的是，IGI 也正在探索该技术在碳捕获和储存能力方面的应用，这项今年宣布的计划由马克·扎克伯格夫妇的 Chan Zuckerberg Initiative（CZI）基金会资金支持。目前，IGI 对光合作用和根系的大多数初步研究都将集中在水稻上。与此同时，该研究所还将致力于为难以破解其遗传学密码的高粱开发更好的基因编辑技术。

2022 年是 CRISPR 基因编辑技术诞生十周年，在一次与 GEN Biotechnolgy 的对话中，Jennifer Doudna 认为 CRISPR 将继续在农业中发挥巨大影响力。“几年前，我们研究所（IGI）就决定把重点放在农业应用上，这是因为我们认识到基因编辑对支撑农业的植物和土壤微生物的巨大需求和机遇的结合。”

参考链接：
1.https://doi.org/10.3390/plants11192494
2.https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2022.09.015
3.https://www.pairwise.com/
4.https://www.broadinstitute.org/crispr/information-about-crispr-cpf1-cas12a-systems
5.https://www.broadinstitute.org/news/scientists-discover-new-system-human-genome-editing-potential-increase-power-and-precision
6.https://en.wikipedia.org/wiki/Cas12a#cite_note-nat-4
7.https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.09.038