神经生物学科研常用病毒部件解析

Besson

又双叒叕要文献阅读汇报了！！
浅浅汇总一下目前见到的病毒背景吧（可能会持续更新）不熟悉各种病毒，一长条的病毒的名字分别代表什么含义也不知道，结果每次做汇报PPT都要跳转各个网页找病毒背景真的好累啊，于是总结一下各种病毒相关的内容，也分享给大家，希望能给刚开始读这方面文献的朋友们一点帮助，不要像我当初那样找半天，这里一点那里一点找得好苦(﹏)
因为自己也只是小白，所以发现有错误的地方麻烦大佬多多指正啦（鞠躬）
病毒注射后表达方向

顺向(Anterograde)是由注射部位的神经元胞体经轴突下行至末梢；
顺向跨突触（Anterograde transneuronal）是从胞体传到轴突末梢后跨过突触传递至下一级神经元；
retro：逆向(Retrograde)是由轴突末梢传到细胞体；
逆向跨突触（Retrograde transneuronal）是由胞体逆向跨突触传递至上一级神经元的轴突。



AAV标记神经元的方式(Strick P L et al.eLS,2011)

RV-EnVA-△G-dsRed：神经示踪逆向跨单突触病毒

rabies virus，RV狂犬病毒：野生型RV是人畜共患的狂犬病的致病因子，在神经系统中具有传播属性，对人和动物均具有较高致病性。随着反向遗传学手段的成熟，经过改造的RV，可用于神经回路研究。RV感染中枢系统后，主要标记神经元，几乎不标记胶质细胞；被感染的神经元在一定时间内（7-12天）几乎不发生明显病变及裂解。Wickersham 等基于RV疫苗株Sad B-19感染性克隆构建的复制缺陷型重组RV具有较低的毒性和较高的安全性，可清晰的标记神经元的精细形态，并通过反向互补策略实现了对神经网络联接的逆向跨单级突触追踪。
EnvA：利用重组的禽类肉瘤病毒（Aviansarcoma-leukosisvirus，ASLV）的外膜蛋白（EnvA）融合蛋白包装RV形成的病毒粒子，可特异性识别EnvA的受体TVA（TVA只存在于禽类细胞中，在哺乳动物神经元中无表达）介导病毒特异性地感染细胞。利用Cre转基因鼠结合Cre-LoxP控制表达TVA及G蛋白的AAV辅助病毒，可实现只在特定区域特异类型神经元中表达TVA及G蛋白，从而利用RV-EnvA-ΔG实现对特异类型神经元的逆向跨单级突触标记。
ΔG：RV的囊膜糖蛋白（glycoprotein，G）是其逆行跨突触所必需的蛋白，其受体大量分布在轴突末端，感染后可沿轴突逆行进入神经元胞体开启病毒复制，G蛋白缺失的RV（RV-ΔG）会丧失跨突触能力，而其复制及转录不受影响（可持续高丰度表达外源基因），因此，RV-ΔG携带报告基因后，其功能类似CTB，retrobeads等，可逆向高亮度标记神经元精细形态。另外，补偿RV-G蛋白，可辅助RV-ΔG逆行跨突触感染上一级神经元，从而实现跨单突触神经网络标记。
DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein）香菇珊瑚红色荧光蛋白)： 香菇、珊瑚红色荧光蛋白融合蛋白



RV-EnvA-ΔG实现神经元的逆向跨单级突触标记（Callaway et al.,The Journal of neuroscience:the official journal of the Society for Neuroscience, 2015）

腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV)
AAV：野生型 AAV 是一种复制缺陷型微小病毒，需要腺病毒或疱疹病毒帮助其在体内复制扩增。
rAAV（Recombinant adeno-associated virus）重组腺相关病毒:  做实验用的是不需要辅助病毒的重组 AAV 病毒（rAAV）。将目的基因的 CDS 区序列或者 RNAi 干扰序列插入 rAAV 表达质粒中，包装病毒，然后直接使用 rAAV 感染细胞就能完成目的基因操作。
免疫原性低：当 AAV 用局部大剂量感染肌肉、脑、眼等组织时，很少有感染上的细胞之后被免疫系统所清除。这种特性对于动物实验上显然极有帮助。感染谱广：几乎所有处于分裂期和静止期的细胞都可以使用 AAV 来感染。表达时间长：rAAV 可在宿主细胞中形成附加体（episome）存在于细胞核中，在细胞分裂不旺盛的组织中可持续表达 5 个月以上。扩散性强：rAAV 具有远高于腺病毒和慢病毒的扩散性，可以穿透血脑屏障，是最理想的神经元和胶质细胞感染工具。
ssAAV（single-stranded AAV）：ssAAV包装基因组正义链和反义链的几率一样。ssAAV在入核、脱衣壳后，需要借助宿主DNA聚合酶或者分子间退火完成双链转化，才能启动基因转录过程
scAAV （self-complementary AAV）：scAAV中已存在双链，它入核后即可启动基因转录，跨过了双链转化的步骤，从而实现外源基因的快速表达
不同AAV血清型的组织亲和性

AAV1载体：CNS、RPE(Retinal Pigment Epithelium)、Skeletal Muscle
AAV2载体：泛嗜性；最早套用的AAV载体。CNS、Kidney、Photoreceptor Cells、RPE(Retinal Pigment Epithelium)。有效转导肌肉，肝脏，脑组织，对于视网膜的转导效率和表达水平良好
AAV4载体：CNS、Lung、RPE(Retinal Pigment Epithelium)；
AAV5载体：视网膜、神经系统、关节滑膜嗜性、肺；
AAV6载体：Lung、Skeletal Muscle；
AAV7载体：Liver、Skeletal Muscle；
AAV8载体：明显肝嗜性，视网膜、神经组织也可以感染；
AAV9载体：心肌嗜性，可穿过血脑屏障；
AAV-DJ：广谱性侵染各种细胞；
腺病毒(Adenovirus，AdV)

腺病毒是一种双链线性无包膜的DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
慢病毒（lentivirus，LV）

慢病毒（lentivirus）是逆转录病毒的一种，是RNA病毒，需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒。慢病毒区别于一般的逆转录病毒，它可以感染分裂和非分裂细胞，并能将外源基因整合到宿主基因组上实现长期稳定的表达，是体外和体内基因传递的有效工具。慢病毒是以HIV-1为基础发展起来的基因治疗载体。
慢病毒有广泛的宿主范围，能够有效地感染分裂细胞、非分裂细胞，特别适合于一些难转染的细胞（如原代细胞、干细胞、不分化的细胞）和对腺病毒染具有较强免疫反应的细胞（如树突状细胞、单核细胞和间充质干细胞）等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加。同时适用范围更广，不仅能用于体外实验，还能用于活体动物模型，尤其是动物成瘤实验。
Cre-LoxP系统之类的东西

Cre-LoxP系统是一种重组酶系统，能够控制基因组DNA中位点特异性重组的发生，被广泛应用于特异位点的基因敲除、基因插入、基因翻转和基因易位，可达到在基因水平上对生物体进行定向遗传改造的目的，其主要由Cre与LoxP两部分组成。Cre是一种重组酶，于1981年从P1噬菌体中发现，属于AInt酶超基因家族。Cre重组酶，能够特异性识别LoxP位点，使2个LoxP位点之间的DNA进行精确的位点特异性重组。LoxP则是位于P1噬菌体中的34bp序列，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成，间隔序列决定了LoxP的方向。



① 当两个LoxP在一条DNA链上且方向相同，Cre删除两个LoxP间的序列；② 当两个LoxP在一条DNA链上但方向相反，Cre诱导两个LoxP间的序列翻转；③当两个LoxP分别在两条不同的DNA链或染色体上，Cre诱导两条DNA链发生交换或染色体易位； ④当四个loxP分别在两条不同的DNA链或染色体上，Cre诱导loxP间的序列互换

###DO系统（Cre-off）插入基因与启动子方向一致，在Cre重组酶存在的情况下会发生重组导致基因方向反向，因此基因不表达，所以称之为Cre-Off
###DIO系统（Cre-on）插入基因方向与启动子方向相反，在Cre重组酶不存在的情况下不表达，只有当Cre酶存在时，发生重组使基因方向与启动子方向一致，才能使该基因表达，因此该系统称之为Cre-On。
###Cre-Switch系统（Cre-off/on）对于Cre-Switch来讲，则是在LoxP序列之间插入了两个阅读框，而这两个阅读框的方向相反，则可以通过Cre酶的存在与否来控制这两个基因的表达。
###FLEX系统（Cre-on）FLEX系统与DIO系统一致，只是LoxP位点方向与DIO系统不同。插入基因方向与启动子方向相反，在Cre重组酶不存在的情况下不表达，只有当Cre酶存在时，发生重组使基因方向与启动子方向一致，才能使该基因表达。
DIO（Double-floxed inverse Orientation）：和Cre重组酶配合控制目的基因表达的元件。如果没有Cre重组酶的话目的基因不表达，在有Cre 的情况下目的基因才能开始表达。属于Cre-loxP系统。常用在Cre基因鼠上，或将Cre打进小鼠体内。
fDIO (Flp controled Double-floxed inverse Orientation) ：FLP是一种位点特异DNA重组酶，类似于Cre。fDIO是和Flp（flippase）配合控制目的基因表达的元件，一般由两对互不相容的FRT序列组成，特征序列是FRT-间隔1-FRT5-GOIr-FRTr-间隔2-FRT5r。同Cre-loxP系统一样，fDIO特异性更强。属于Flp-Frt系统。
器官特异性启动子（神经部分）

ALDH1L1：醛脱氢酶1家族成员L1启动子。丘脑中星形胶质细胞特异性启动子
CaMKIla（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase ll）钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Il a：兴奋性神经元启动子，即谷氨酸能神经元特异性启动子。大脑新皮质和海马兴奋性神经元特异性启动子
CD68：小胶质细胞特异性启动子
c-fos：c-fos基因启动子，兴奋性神经元启动子
EF1α：启动子。适合干细胞、原代细胞、造血细胞等的表达，在常用细胞如HEK293、肿瘤等细胞系
GFAP：胶质纤维酸性蛋白启动子，星形胶质细胞特异性启动子
GFAP104：EF1a和GFAP的嵌合型启动子，星形胶质细胞特异性启动子
GfaABC1D(truncated GFAP)：胶质纤维酸性蛋白启动子，星形胶质细胞特异性启动子
hSyn（human Synapsinl）：突触蛋白1启动子。成熟神经元特异性启动子。该启动子在不同类型的成熟神经元中均可发挥作用。
MBP：髓磷脂碱性蛋白启动子，少突胶质细胞特异性启动子
Mecp2：甲基 CpG 结合蛋白 2启动子，短的神经元特异性启动子
NSE：烯醇化酶启动子，神经元特异性启动子
Somatostat(SST)：生长抑制素I基因的启动子，γ-氨基丁酸能抑制性神经元SST亚型特异性启动子
TH：酪氨酸轻化酶基因启动子，多巴胺能神经元特异性启动子
标签序列

3×FLAG：蛋白标签，用于基因过表达
IRES(Internal ribosome entry site)：一个500-600 bp的基因工程原件。IRES能引导核糖体进入该序列，翻译3'方向的开放阅读框（ORF），通常在双顺反子载体中应用最多。核糖体在遇到IRES后，可以再重新结合到mRNA上进行翻译。起到良好的“再启动”作用
WPRE：转录后调控序列，增加外源片段的表达效率，提升病毒包装的滴度
pA：ployA的尾巴，真核生物mRNA的3’端都存在的一段序列，可以起到稳定mRNA的作用


化学遗传学病毒元件

与氯氮平CNO（clozapine-N-oxide）搭配使用：
Gq，Gs, Gi：Gq和Gs是激活性受体，而Gi是抑制性受体
hM4D(Gi) 又名hM4Di：hM4D(Gi)是从人毒蕈碱乙酰胆碱受体M4 上改造的仅对氯氮平CNO（clozapine-N-oxide）有反应的人工受体（designer receptors exclusivelyactivated by designer drugs，DREADD），不再受乙酰胆碱激活。在一些神经元里，CNO 结合hM4D 后，激活Gi 蛋白偶联的内向钾离子通道GIRK，使得细胞膜超极化，抑制神经元细胞动作电位发放。
hM3D(Gq) 又名hM3Dq：hM3Dq（Gq）是人M3毒蕈碱（hM3）受体的一种修饰形式，可被氯氮平CNO（clozapine-N-oxide）激活，参与Gq信号通路。Gq信号可释放细胞内储存的钙，增强神经元的兴奋性。因此，表达hM3Dq的神经元经CNO处理后，其发放频率（firing rate）急剧增加。
光学遗传学病毒原件




光遗传学的基本原理（Karl Deisseroth, et al., Annu. Rev. Biomed. Eng., 2014）

激活神经元的通道蛋白

ChR2：紫红质通道蛋白2，是从单细胞绿藻莱茵衣藻上分离的一种光敏感通道蛋白
ChR2(H134R)：470nm蓝光激发。ChR2的突变体，该蛋白质可以产生两倍的光电流，但通道开关速度也比野生的ChR2慢了一倍。
ChR2(C128S/D156A)：ChR2的突变体，SFO光敏通道，用470nm激活通道，然后用590nm激光关闭通道，可以打开其离子通道长达30分钟。
ChETA：470nm左右蓝光激发。ChR2的突变体，具有更快的动力学变化，某些神经元在激光刺激下可以发放200Hz的spike。
oChIEF：450nm-470nm蓝光激发。在某些神经元中可以响应高频光（--100Hz）刺激，加速通道关闭的速度，在持续光照刺激下减少失活率。
C1V1：540nm-560 nm激发。红移视蛋白，该通道蛋白类型更利于双光子激发。
Chronos：500-530nm激发。高光敏度及快速开关动力学。
ChrimsonR：590-600nm激发。做了K176R的点突变，增加了通道的关闭速度，适合用于刺激频率较高的场合。
ST-ChroME：530nm左右激发，胞体定位，激活型ChroME通道。
ChRger：470nm蓝光激发。相对无创（光纤放置在颅骨表面）。
抑制神经元活动的通道蛋白

NpHR：即为Halorhodopsin，第一个有效抑制神经元活动的光遗传学工具，在黄绿激光照射下会将氯离子打进神经元内，而抑制神经元活动。当把NpHR表达在哺乳动物脑内时，会聚集在内质网上。
eNpHR2.0：如果将内质网输出元件加在NpHR基因序列后面，这样可以使得NpHR在胞内高量表达，而且不会聚集在内质网上，这样修改过的NpHR被称为eNpHR2.0。
eNpHR3.0：589nm黄光激发。eNpHR2.0在细胞膜的聚集仍然不够，而将一个高尔基体输出元件和来自于钾离子通道Kir2.1的上膜元件加在eNpHR2.0基因序列后面，这样就能实现在神经元细胞膜上的高量聚集，这样修改过的NpHR被称为eNpHR3.0。eNpHR3.0 对细胞膜的靶向性较好，电流较为持久，响应时间短，反应灵敏。
Arch：566nm左右激发。即为archaerhodopsin，是一种黄色激光激活的外向整流质子泵，能够将带正电的质子从神经元内移动到细胞外环境中，使神经元处于超极化状态。在特定条件下，可用于增加细胞内pH或减少细胞外基质pH。和NpHR相比，当激光关闭的时候，Arch立即从通道打开状态恢复到关闭状态。
Mac：540nm激发。即为 Leptosphaeria maculans fungal opsins，是一种能够将带正电的质子从神经元内移动到细胞外环境中的质子泵，使神经元处于超极化状态。
Jaws：632nm激发，红移视蛋白，红光照射下会使氯离子内流，从而抑制神经元活动。
ST-eGtACR1：515nm激发。GtACR是一个Cl-通道，效率比NpHR、Arch等离子泵高很多，快速抑制。适合照光时间特别短、行为效应特别短的情况。ST-eGtACR1为其胞体定位版本。



常见光敏感通道特性（Karl Deisseroth’s, Nat Methods,2012）

钙光纤病毒原件

GCaMP：GCaMP系列蛋白（Single-fluorophore）特别是GCaMP6系列蛋白是最主要的钙离子指示剂，且越来越多地被用于体内钙成像研究。GCaMP6比GCaMP3强10倍，动力学快2倍。其中GCaMP6s (slow)，6m (medium)，6f (fast)分别代表慢，中，快三种动力学性质（动力学越快越适合检测快速变化的钙信号）。GCaMP6s荧光变量最大，GCaMP6f最灵敏。
荧光标记

GFP（Green Fluorescent Protein）绿色荧光蛋白：在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。GFP蛋白质最早是由下村脩等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。
EGFP（Enhanced Green Fluorescent Protein）：EGFP是增强型的GFP，发生了双氨基酸取代，Leu(亮氨酸)取代GFP上的Phe64(苯丙氨酸)，Thr(苏氨酸)取代了GFP上的Ser65(丝氨酸)，与GFP相比，具有更强更稳定的绿色荧光，发射出的荧光强度比GFP大6倍以上。
YFP（Yellow Fluorescent Protein）：黄色荧光蛋白，其序列与GFP基本相同。
CFP（Cyan Fluorescent Protein）：是GFP第66位上的酪氨酸Tyr被色氨酸（Thr）所取代的结果，发蓝色荧光。
mCherry：单体红色荧光蛋白（mRFPs）mFruits家族的成员，在540-590nm之间吸收光，在550-650nm范围内发射光。来源于碟形海葵的DsRed。
其他

滴度（Titer）：单位体积液体中有感染能力的病毒数目
IFU/ mL（infectious units per mL）：病毒滴度单位，表示每毫升病毒能够有效感染的靶细胞数目。病毒滴度采用梯度稀释法测定。
TU/mL（transducing units）活性滴度单位：表示每毫升可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数
参考：

AAV_百科
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Flp-Frt系统/FIp依赖/表达策略/病毒载体/病毒包装/腺相关病毒(AAV),布林凯斯(深圳)生物技术有限公司- 960化工网
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神经科学中的常用病毒部件解析，这篇就够了（适合初学者）
神经示踪逆向跨单突触病毒RV-EnVA-△G-dsRed,武汉枢密脑科学技术有限公司 - 960化工网
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