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Nat Biotech | 高通量揭示上千种药物作用机制

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online_member 发表于 2023-1-10 20:41:10 | 显示全部楼层 |阅读模式
原创 huacishu 图灵基因 2023-01-10 12:12 发表于江苏
收录于合集#前沿分子生物学机制


Nat Biotech | 高通量揭示上千种药物作用机制704 / 作者:Qian723 / 帖子ID:103368

撰文:huacishu
IF=68.164
推荐度:
亮点:
1、展示了该数据集如何揭示化学扰动诱导蛋白质组重塑的机制;
2、鉴定了调节HCT116细胞中9000多种蛋白质表达的化合物;
3、化学诱导蛋白质指纹数据库揭示了响应扰动而发生的蛋白质共表达的基本和重复模式。


Nat Biotech | 高通量揭示上千种药物作用机制871 / 作者:Qian723 / 帖子ID:103368

哈佛大学医学院Steven P. Gygi教授课题组在国际知名期刊Nat Biotechnol在线发表题为“A proteome-wide atlas of drug mechanism of action”的论文。定义细胞对药物的反应对于理解小分子干预的作用机制至关重要。本文作者开发了一种基于96孔板的定量蛋白质组高通量筛选基础设施,并在人类癌症细胞系中提供了875种化合物,其蛋白质组覆盖率接近百分之百。


Nat Biotech | 高通量揭示上千种药物作用机制834 / 作者:Qian723 / 帖子ID:103368


作者检查24小时的蛋白质组变化,揭示了配体诱导的蛋白质表达变化,并揭示了化合物调节其蛋白质靶点的规则。作者使用蛋白质-蛋白质和化合物-化合物相关网络来揭示几种化合物的作用机制,包括肾上腺素能受体拮抗剂JP1302,结果显示其破坏FACT复合物并降解组蛋白H1。通过提供具有覆盖广泛化学空间的重叠靶标的许多化合物,作者将化合物结构与作用机制联系起来。

小分子调节剂通过多种机制影响其靶蛋白。解开这些生物活性分子的作用机制(MOA)可以更好的对疾病的治疗进行干预。尽管有针对性的方法可以评估特定化合物对所选信号通路和细胞过程的影响,但需要系统水平的分析来定义药物和工具化合物的MOA。最近,已经采用了几种高通量质谱(MS)方法来表征化合物MOA,以增强对化学扰动引起的蛋白质表达变化的理解。

本文作者量化了“蛋白质组指纹”,描述了875个小分子干预作为MOA去卷积和化合物再利用的资源的蛋白质组范围效应,从而揭示了HCT116蛋白质组中对化学扰动最敏感的那些部分。这一资源涵盖了一个比以前大十倍的文库,突出了蛋白质组的深入剖析如何揭示了蛋白质组对药物反应的细微差别。该资源将为药物发现提供信息,并揭示药理学干扰后蛋白质共表达的基本和反复模式。

药物MOA蛋白质组综合分析平台
作者的首要目标是了解不同类别蛋白质的调节剂如何影响蛋白质组重塑,并了解研究不足的化合物的影响。为了实现这些目标,需要使用一个涵盖广泛化学空间的大型筛选库。这项工作最终选择的筛选文库由875个小分子组成,当包括所有已知靶点时,这些小分子靶向914个蛋白质,约占可靶向蛋白质组的一半(图1)。从高度引用的FDA批准的药物到大量未描述的化学工具(图1b),该库包括临床开发各个阶段的化合物。


Nat Biotech | 高通量揭示上千种药物作用机制185 / 作者:Qian723 / 帖子ID:103368


利用该工作流程,作者实现了蛋白质组的深度覆盖,量化了9960个观察到的蛋白质中每个化合物8863个蛋白质的中值(每个化合物89%的覆盖率;图1c)。数据的完整性非常好,至少一半的文库(438种化合物)中约有8900种蛋白质被量化。

蛋白质组由小分子动态调节
每个化合物与一个或多个蛋白质靶点相互作用,并通过反映其MOA的细胞过程的共同和微扰特异性调节来诱导蛋白质组水平的变化。这些微小扰动引起的丰度变化在蛋白质之间的大小不同。

使用定义标准,作者确定超过一半的可量化蛋白质组因一种或多种化合物而变化至少两倍,而98%的量化蛋白质显示出一种或多种化合物导致的五个标准偏差的丰度变化(图2a)。此外,超过4000种蛋白质被至少一种化合物高度(超过两倍)下调,揭示了许多潜在的配体诱导降解事件。总体而言,作者发现了141786个调控事件,少于数据集中763万个蛋白质测量值的2%(图2b)。


Nat Biotech | 高通量揭示上千种药物作用机制743 / 作者:Qian723 / 帖子ID:103368

然后,作者鉴定了对干预治疗有异常频率反应的蛋白质,这些蛋白质通常与常见的耐药性或压力应对途径有关。频繁响应的蛋白质仅在一个方向上发生变化的显著倾向(图2c)。

优先上调的蛋白质富含类固醇生物合成、细胞因子-细胞因子-受体相互作用、有丝分裂和铁死亡途径的蛋白,这表明HCT116细胞通过上调自噬和甾醇代谢来克服外源性应激。同样,下调的蛋白质富含来自多种细胞周期相关途径的蛋白质,这表明这些细胞通常通过细胞周期阻滞对扰动诱导的应激作出反应(图2d)。

靶蛋白的调节揭示化合物MOA
作者在数据集中识别了875种化合物的约一半注释的主要靶点,90%的靶蛋白在包含感兴趣化合物的11个复合物中被量化(图3a)。对于该分析,作者还为每个化合物添加了一个额外的二级靶标,如果适用,将会产生541个化合物靶标对。作者发现,15%的化合物以约1.56倍的中值调节其靶蛋白的表达(图3b),上调比下调更频繁。即使是小幅度的调节事件,在重叠的化合物类别中也是可重复的。


Nat Biotech | 高通量揭示上千种药物作用机制262 / 作者:Qian723 / 帖子ID:103368

配体诱导的蛋白质表达变化通常在调节许多其他蛋白质及其靶标的高活性化合物中观察到(图3c)。这表明,许多调控事件是干扰重要细胞过程的间接后果,不一定直接由配体-靶标结合引起。当几种化合物靶向相同的蛋白质时,常常观察到目标蛋白质丰度的类似变化。

利用可重复的化合物诱导的上调,作者确定了三种上调DHFR的化合物,其幅度和特异性与临床上使用的已知DHFR抑制剂伊卡普利和乙胺嘧啶相当(图3d,e)。

TNKS1/2抑制剂可复制地诱导PARP tankyrase-1/2(TNKS和TNKS2)大的差异倍数,这两种相关的ADP核糖酶影响包括WNT信号在内的多种途径。这些蛋白也被蛋白酶体和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂以及PARP抑制剂talazoparib上调(图3f)。作者还注意到双特异性激酶CLK1的频繁上调(图2c)。整个CLK激酶家族通常在用激酶抑制剂(包括强效CLK抑制剂KH-CB-19和mL167)处理的细胞中上调(图3g)。

接下来,作者使用整个蛋白质组指纹数据库,通过关联所有可能的化合物对的蛋白质组图谱来生成MOA相似性网络,形成了一个化合物-化合物相关网络,该网络包含382375条可能边缘中的2543条(图4a)。在875种化合物中,295种与另一种化合物具有至少种显著的相关性。从该网络中,确定了由具有重叠靶标的化合物组成的相互连接的群落,其关联反映了共享的生物学(图4b–h)。


Nat Biotech | 高通量揭示上千种药物作用机制740 / 作者:Qian723 / 帖子ID:103368

作者还发现用PLK1抑制剂volasertib和BI-2536(图4e)以及BET抑制剂birabresib、CPI-203和JQ-1处理的细胞的蛋白质组之间存在重叠,它们通过与BD1和BD2的相互作用来抑制BRD4(图4d)。与该群落密切相关的是RVX-208,这是一种BD2选择性BET抑制剂,目前正在进行心血管疾病的临床试验。虽然该群体反映了PLK1和BRD4抑制剂处理的蛋白质组之间的强烈重叠,但RVX-208 MOA的轻微差异是明显的。

几个MAPK抑制剂形成了一个紧密的群落,MEK抑制剂MEK162和RAF抑制剂AZ628在这组中相关性最高(图4f,g)。最后,注意到库中的一组三种蛋白酶体抑制剂(图4h),这些抑制剂等效地抑制蛋白酶体降解(图4i)。

蛋白质-蛋白质相关性揭示药物反应途径
接下来作者生成了一个蛋白质-蛋白质相关网络,假设具有共同功能的蛋白质将被具有重叠靶点的化合物共同调节。因此,将所有可能的蛋白质对的相对表达谱相关联,并将所得皮尔逊相关矩阵过滤为1% FDR。最终的网络(图5a)包含2388个节点和35936个边缘。


Nat Biotech | 高通量揭示上千种药物作用机制888 / 作者:Qian723 / 帖子ID:103368

该蛋白质-蛋白质相关网络的聚类揭示了由细胞功能组织的蛋白质群落,因为大的聚类富含来自细胞周期、RNA加工、代谢和胆固醇生物合成分子功能本体的蛋白质。提取这些群落中更强的蛋白质相关性揭示了蛋白质组织成已知复合物,包括着丝粒,其亚基NDC80-NUF2在数据集中具有最高的蛋白质水平相关性(图5b)。

在更大的网络中,作者发现了富含p53信号蛋白、NAD脱氢酶(NDUFs)、tRNA合成酶和氨基酸转运蛋白以及氧化应激蛋白的群落。核糖体蛋白细分为两个不同的群落,分别对应于80S和线粒体核糖体,这表明这些复合物是由小分子独立调节的。

最后,相关网络分析揭示了功能关联。例如,乙酰辅酶A羧化酶1和2(ACACA和ACACB)强烈相关(图5d)。

相关蛋白的成对图可以突出显示驱动两种高度相关蛋白调节的化合物。然而,也可以定义协同调节不同蛋白质群落的化合物家族(图5e,f)。这些分析突出了这一资源在定义已知生物过程的新成员以及识别驱动感兴趣的途径和过程的药物和工具化合物方面的能力。

JP1302抑制转录
为了测试该数据集在MOA反褶积中的效用,作者通过靶表达分离化合物,并鉴定了几个靶蛋白在HCT116细胞中未检测到的高活性化合物(图6a)。其中包括JP1302,被注释为α肾上腺素受体拮抗剂。尽管在HCT116细胞中无法检测到ADRA2C,但JP1302处理诱导了与几种RNA转录抑制剂相关的蛋白质组指纹(图6b)。这些相关化合物包括ATP竞争性CDK9抑制剂flavopiridol、AZD5438和PHA767491。


Nat Biotech | 高通量揭示上千种药物作用机制329 / 作者:Qian723 / 帖子ID:103368

接下来应用蛋白质-蛋白质相关性分析来进一步定义这组抑制剂的机制。作者发现了几种导致p53表达增加而MDM2/p21表达减少或保持不变的化合物(图6c)。该分析进一步表明JP1302可能抑制RNA转录。为了进一步表征该化合物的MOA,将JP1302的蛋白质组变化与转录激酶CDK12和CDK13的特异性抑制剂THZ513诱导的变化进行了比较。THZ513治疗立即阻止RNA转录,降低蛋白质表达。

尽管这两种化合物类似地下调了蛋白质表达(图6d),但JP1302处理中几种下调的蛋白质是独特的(图6e)。其中三个组蛋白亚基H2AZ1、HP1BP3和H1FX对药理学干扰具有抗性(图6f)。JP1302处理的细胞中蛋白质组变化的时间分辨分析显示H1接头组蛋白的快速降解(图6g)。

虽然观察到CDK9/12/13抑制剂flavopiridol治疗后没有效果,但JP1302和CBL0137都改变了许多RNA转录蛋白的热稳定性,FACT复合物亚基SUPT16H受影响最大(图6h)。 这些发现表明JP1302是研究FACT复合物抑制和连接蛋白降解的新化学工具。

最后,我们通过评估不同浓度的Pol II磷酸化和p21表达,评估了JP1302作为FACT复合物抑制剂的效力。与CBL0137、THZ531和其他三种CDK9抑制剂相比,用10 M JP1302处理可抑制Pol II磷酸化和p21表达(图6i)。为了进一步阐明JP1302在不同浓度下的MOA,作者研究了剂量依赖性蛋白质组重塑,并发现随着JP1302浓度的降低,治疗后上调和下调的蛋白质的相对数量有所不同,表明通路激活中存在浓度依赖性差异(图6j)。

然后,将从每个浓度获得的蛋白质组指纹插入化合物-化合物相关网络(图6k)。根据KEGG通路预测,用1M JP1302处理的细胞与激活p53的MDM2抑制剂最接近,而更高浓度的细胞与先前观察到的相同化合物聚集。总之,这些数据突出了蛋白质组指纹资源可用于确定未知化合物的不同MOA的许多方式。

细胞暴露于药物和工具化合物通常会诱导蛋白质组重塑,其中具有相似MOA的化合物具有相似的蛋白质组变化。使用综合分析方法对这些变化进行文库规模表征,为未来药物发现工作提供了化合物作用的机制注释。

教授介绍


Nat Biotech | 高通量揭示上千种药物作用机制250 / 作者:Qian723 / 帖子ID:103368

Steven Gygi博士获得犹他大学药理学和毒理学博士学位,从事小分子质谱分析。1996年,他继续在华盛顿大学从事博士后工作。2000年,Steven Gygi博士搬到哈佛医学院,加入细胞生物学系。Gygi实验室的研究重点是开发和应用基于质谱的蛋白质组学领域的新技术。这些包括对许多蛋白质特性的系统和蛋白质组范围的测量,包括它们的表达水平、修饰状态、结构、定位、功能和相互作用。例如,Gygi实验室和HMS的Harper实验室正在创建细胞中蛋白质-蛋白质相互作用景观的基因组规模图(称为BioPlex)。此外,串联质谱标签(TMT)等样品复用技术正在改进,以允许使用高分辨率质谱法同时分析多达16个蛋白质组样品。

参考文献
Mitchell DC, Kuljanin M, Li J, et al. A proteome-wide atlas of drug mechanism of action. Nat Biotechnol. 2023;10.1038/s41587-022-01539-0. doi:10.1038/s41587-022-01539-0

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