Nature | FIND-seq专注稀有细胞群, 发现星形胶质细胞调控因子

张王赵高痔

原创 风不止步 图灵基因 2023-01-12 12:12 发表于江苏
收录于合集#前沿分子生物学技术




撰文：风不止步
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文章描述了FIND-seq（通过核酸检测和测序对细胞进行重点询问）的发展和应用，这种方法能够对由RNA或DNA标记物定义的罕见细胞亚群进行高通量和深入测序。FIND-seq能够确定一个可治疗的机制，限制XBP1驱动的致病星形细胞反应。FIND-seq允许研究以前无法接触到的细胞，包括由独特的基因表达特征或其他核酸标记定义的罕见细胞亚群。




2023年1月4日，美国哈佛医学院的 Adam R. Abate博士等人在《Nature》上发表了一篇“Identification of astrocyte regulators by nucleic acid cytometry”的文章，文章利用FIND-seq与条件性敲除小鼠、体内CRISPR/Cas9驱动的遗传扰动研究以及小鼠EAE和人类MS样本的批量和单细胞RNA-seq分析相结合，发现核受体NR3C2及其核心压迫因子NCOR2在限制XBP1驱动的致病星形细胞反应中的新作用。




在中枢神经系统（CNS）炎症的背景下，小细胞亚群在组织病理学中具有重要作用。例如，星形胶质细胞是驻扎在中枢神经系统的胶质细胞，在发育、平衡和神经系统疾病中具有多种作用；通过单细胞测序确定的小星形胶质细胞亚群已被证明能促进或限制多发性硬化症（MS）及其临床前模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的中枢神经系统病变。然而，大多数星形胶质细胞亚群（以及使用单细胞基因组学确定的许多其他感兴趣的细胞）缺乏独特的表面标记，限制了它们的分离和进一步调查。此外，单细胞方法必须对大量的细胞进行测序，以充分分析稀有的目标细胞。除了成本高和浪费之外，由此产生的转录组覆盖率也很稀少。




尽管缺乏询问许多星形胶质细胞亚群特性的工具，但正在使用单细胞方法编制越来越复杂的转录标记物数据库。使用这些数据集定义的星形胶质细胞的分类往往是不可能的，因为它们的核酸特征没有映射到独特的表面标记，从而使它们被分离出来。当核分离是实现足够的RNA-seq数据质量的必要条件时，情况尤其如此，中枢神经系统的许多细胞就是如此。与荧光激活细胞分选相联系的荧光原位杂交可以根据直接检测RNA标记物来分离细胞，但对低拷贝目标不敏感，而且这种方法中使用的苛刻的固定剂会降解mRNA，干扰从分选的细胞中产生高质量的测序数据。

此外，获得可检测的信号往往需要使用多个分层探针，限制了对敏感的转录后事件（如RNA剪接）的检测。相比之下，采用基于扩增的核酸检测的液滴方法实现了单分子灵敏度，并能可靠地区分转录本拼接异构体，但在裂解和热循环过程中的mRNA降解限制了测序数据质量，即使许多细胞被汇集在一起。研究由核酸标记物定义的稀有细胞的理想方法将结合PCR检测的特异性和敏感性以及获得高质量分选后测序数据的能力。




文章描述了FIND-seq，一种高通量的方法来分离和测序由核酸标记物定义的稀有细胞，并利用它来研究与多发性硬化症和EAE中枢神经系统病理学相关的XBP1驱动的星形细胞亚群。FIND-seq是研究单细胞基因组研究中确定的细胞亚群的独特工具，因为它可以直接针对定义它们的核酸标记。FIND-seq从数以百万计的输入细胞中捕捉稀有细胞群，产生高质量的转录组数据，并与scRNA-seq兼容。

重要的是，FIND-seq在专注于重要的稀有细胞群时，消除了对大量背景细胞进行测序的需要和相关的高成本。因为FIND-seq可以根据RNA标记物对细胞进行分类，包括剪接的转录物、非编码RNA或病毒RNA的存在，它有可能加速对无法获得转基因动物或抗体的细胞的研究。




此外，FIND-seq在多孔、生物相容性和热可逆的水凝胶中灵活处理数百万个输入细胞，使其在未来的迭代中与额外的多组学读数兼容，包括基因组、表观基因组或蛋白质组测量。然而还需要进一步优化，以结合FIND-seq对亚细胞区间（如星形胶质细胞内膜）转录物的检测。新的高维、全基因组和单细胞技术正在迅速发现与广泛的生理功能和神经系统疾病相关的星形细胞亚群。

然而，如果没有分离这些亚群的技术，要确定控制这些亚群的分子机制，并发现其治疗调节的候选目标，仍然具有挑战性。例如，FIND-seq能够调查与多发性硬化症和朊病毒病的中枢神经系统病理相关的罕见的XBP1驱动的星形细胞，从而确定了NR3C2/NCOR2调控途径，该途径在中枢神经系统炎症条件下拮抗了XBP1驱动的刺激诱导星形细胞（SIA）。

有趣的是，NR3C2在星形胶质细胞中的表达和功能以前没有被研究过。数据补充了以前关于配体激活的转录因子在中枢神经系统驻留细胞中对多发性硬化症和其他神经系统疾病的调节作用的报告。NR4A1和NR4A2限制星形胶质细胞、小胶质细胞和中枢神经系统招募的巨噬细胞的促炎症反应。基于小分子对NR3C2活性进行选择性调节的潜力，研究结果确定NR3C2是治疗控制致病性、疾病相关星形胶质细胞的候选目标。




NCOR2促进组蛋白去乙酰化酶招募到由相互作用的核受体识别的靶基因，引入表观遗传染色质修饰，使基因表达沉默。数据突出了表观遗传修饰在星形胶质细胞长期变化中的潜在作用，可能会放大或延续与中枢神经系统病理发展有关的反应，类似于最近在阿尔茨海默病背景下训练小胶质细胞反应的报告。因此，与NCOR2相关的表观遗传程序的药理靶向可能为中枢神经系统炎症和神经变性的治疗调节提供新的方法。

综上所述，文章报告了FIND-seq的发展，这种方法可以分离出由核酸特征定义的罕见细胞亚群。利用FIND-seq发现了一个以前未知的NR3C2/NCOR2调控机制，它控制着一个星形细胞亚群，促进了EAE和潜在的MS的CNS发病机制。

教授介绍




Adam R. Abate
Adam Abate博士是一位物理学家，他的研究将微流体技术用于高通量生物应用。开发了微流体方法来制造由非常精确和一致大小的液滴组成的乳液，并以不同的方式操纵单个液滴的处理和内容物。液滴用于创建微隔室，可以装载单细胞和其他活性物质，例如药物、营养素和检测试剂。通过将不同的微器件组件链接在一起，液滴可以用作微小的“试管”，用于进行化学和生物反应。这允许以每秒数千次的速度进行多个独立的反应，同时使用极少量的总试剂。亚当正在使用这种方法进行定向进化、基因测序和细胞分选。

研究专长：
软物质物理学、基于液滴的微流控技术、单细胞分析、基因组学、下一代测序准备技术、PCR激活的细胞分选、定向进化、酶工程、数字生物学。

参考文献
Iain C. Clark, Michael A. Wheeler et al. Identification of astrocyte regulators by nucleic acid cytometry(2023)

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