分子生物学 第二章 核酸的结构与功能

绘粹凭

2.3 核酸的变复性

核酸的性质有很多，如粘度、紫外吸收等，其中变性复性较为重要。
2.3.1 核酸的变性

核酸在理化因素的影响下，维持双螺旋结构的作用力受到破坏，稳定的双螺旋结构松散为无规则的单链结构，理化性质发生改变，活性下降或丧失。
变性后碱基暴露，OD260增加（增色效应）
引起DNA变性因素:①有机溶剂，尿素、盐酸瓜、甲酰胺等，与碱基形成氢键，破坏双螺旋结构中的氢键；②破坏疏水作用力的；③减少溶液中盐离子的浓度，增强静电斥力；④升高温度，增加分子内能；⑤过酸、过碱，影响氢键的形成以及静电斥力。
热变性是在很窄的温度范围内急剧发生的
定量表示DNA的变性的物理量是熔解温度（Tm），一半DNA发生变形所对应的温度。GC含量越高，Tm越高（Tm可以通过软件或计算公式计算得到）；盐离子浓度低DNA双链结构不稳定Tm较低，随着眼离子浓度升高Tm升高，慢慢趋于一个平台。
2.3.2 DNA的复性

在适当的条件下（如缓慢冷却），两条彼此分开的变性DNA重新缔合形成双螺旋，称为核酸的复性
复性要求两条序列必须相互接触且有互补配对的序列，因此，复性会受到温度、DNA浓度、DNA序列复杂性的影响（我的理解是DNA配对不一定从头开始，两条互补的序列复杂性越低，越容易互补配对）
定量描述核酸的复性，该过程符合二级反应动力学，DNA浓度一定时，达到复性所需的时间一定。通常我们利用 C_{0}t_{\frac{1}{2}} 表示复性的速度，可以用来表示DNA序列的复杂性。由于这个数值是根据动力学计算出的，称为复性动力学复杂性（用一个重复周期中的核苷酸数表示）
原核生物的复性曲线较为简单，一般为反S型，真核生物由于具有单拷贝序列、高度重复序列等，复性曲线呈现阶梯型。


2.3.3 核酸杂交

据互补配对剪辑的单链DNA DNA之间、DNA RNA之间、RNA RNA之间形成稳定的双螺旋结构，称为核酸杂交。
主要有六种
①Southern杂交 主要包括提取DNA应将DNA破碎为相同长度的片段，将DNA和探针（可以通过同位素，荧光、化学等标记）混合在一定温度下保温一段时间，检测有无杂交条带。
②Northern杂交 与Southern杂交不同，Northern杂交主要用于检测RNA。
③In Situ Hybridization 原位杂交，细胞中的染色体展开DNA变性与探针杂交，可直接观察发生杂交的部位。
④Fluorescence In Situ Hybridization 荧光原位杂交，探针能够与荧光标记抗体结合
⑤克隆杂交 常用于直接检测是否含有目的基因片段（影印法得到两盘相同的菌种，对其中的一盘进行克隆杂交，判断其是否含有目的基因，从而对另外一盘的菌种进行筛选，得到含有目的基因的菌落）