Nat Biotech | 新方法可获取单个细胞转录历史记录

寒武季节俨

原创 Rana 图灵基因 2023-01-30 10:11 发表于江苏
收录于合集#前沿分子生物学技术




撰文：Rana
IF= 68.164
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亮点：
1、本研究利用重编程的tracrRNA（Rptrs）、相应的目标DNA序列和Cas9编辑器搭建了称为TIGER的活体检测平台。TIGER方法是指利用重编程的Rptr与被识别转录物配对，将其转换为引导RNA，然后gRNA与Case9碱基编辑器以引入的DNA靶点作为目标，通过测序来读取碱基编辑情况。
2、本研究表明TIGER方法可以记录多个选定的转录本，提供相对转录本水平的定量解读，检测SNP，确定表达的强度或持续时间，捕捉单细胞现象，提供细胞转录历史的详细解读。
3、本研究利用TIGER记录大肠杆菌中的代谢风险和抗生素耐药性以及沙门氏菌对宿主细胞的入侵。基于其在不同细菌中的应用，TIGER可用于跟踪移动遗传元件的传播及其对混合微生物种群的影响，描绘细菌病原体在宿主中的传播路径，或创建间接记录人体和其他环境中健康和疾病状态的前哨细胞。




近日德国德国亥姆霍兹感染研究中心（HZI）Chase L. Beisel团队在nature biotechnology杂志社发表了名为RNA recording in single bacterial cells using reprogrammed tracrRNAs的研究文章。在这篇文章中，研究人员通过重编程设计Rptr，以及相应的目标DNA序列和Cas9编辑器构建TIGER检测平台，通过设计的Rptr与目标RNA配对，形成由cas9结合的gRNA，gRNA将cas9引导到编码在多复制质粒的DNA目标上，从而产生精确和永久的编辑，记录单个细菌细胞内的异源和内源性转录本。通过在大肠杆菌中组成型表达异源转录本验证Rptrs所引导的TIGER对细胞内转录本的检测，发现TIGER可以用来记录不同RNA转录本的存在，同时也可记录单细胞中转录本的状况。




同时发现该平台也可通过区分单核苷酸差异的序列检测单核苷酸多态性（SNPs），并且量化相对转录水平。通过量化TIGER对检测到的转录本的影响，发现减少Rptr表达可以降低被感知的转录本的影响，但同时也降低了记录效率。通过鼠李糖对大肠杆菌糖代谢的诱导表明TIGER可以记录单细胞现象，同时也展现出TIGER方法多路复用记录的功能，记录多个转录本。对TIGER的功能进行验证后研究人员将该技术应用于记录在记录期间进入细胞的非原生转录本，以及记录关键细胞事件中内源性转录本水平的变化这两个领域并取得显著效果。作者表示TIGER仍然是唯一可以在单细胞水平上选择性记录单个rna的方法，在记录更小的、定义的转录本集时，为record -seq提供了潜在的补充。

一个细胞的身份和行为不仅取决于它当前的细胞内组成和细胞外环境，还取决于它过去的状态。过去的状态决定了细胞的轨迹，并塑造了细胞未来的生理和功能，如发育、衰老、癌变等。过去的状态也可以反映不再可检测到的关键事件，例如先前被病毒感染的宿主、通过不同组织转移的细菌病原体或暂时耐受抗生素的细胞。目前，定义细胞状态最常用的方法是测量其转录谱。可以确定RNA转录水平的身份和丰度，以及丰度是否在发生变化。到目前为止，RNA记录是通过CRISPR获取将随机捕获的RNA转换为保存的DNA间隔体来实现的。然而，这种方法需要对大量细胞群进行测序，掩盖单细胞过程。在本研究中，研究人员介绍TIGER (通过遗传编码记录推断的转录RNA)，一种用于记录单个细菌细胞中感兴趣的RNA的存在和丰度的技术。并利用TIGER技术，记录了不同细菌中的信使RNA（mRNA）和小RNA（sRNAs），并具有单核苷酸精度，相对转录水平的量化，多个转录本的记录和单细胞分辨率。应用TIGER记录代谢风险对冲、抗生素耐药性的动员和细菌病原体感染宿主细胞。通过RNA记录，TIGER将当前细胞状态与过去的转录状态连接起来，以破译单细胞中复杂的细胞反应。

用TIGER记录细胞RNA




研究利用之前发现的细胞RNA被转化为引导RNA (gRNAs)，引导RNA被Cas9直接切割DNA。反式激活CRISPR RNA (tracrRNA)是许多CRISPR - Cas系统中的一种RNA处理因子，它通过与细胞RNA杂交形成Cas9识别的结构来负责这种转换。为了在细胞中记录不同RNA的存在，作者引入了DNA编码的三个组成部分：重编程的tracRNAs (Rptrs)、相应的目标DNA序列和Cas9编辑器构建了TIGER平台。在选定的转录本中设计Rptr对，以形成可由Cas编辑器使用的gRNA。然后，编辑器被引导到匹配的DNA序列，仅在存在转录本的情况下创建永久编辑。由于每个DNA靶点对于感兴趣的RNA都是唯一的，因此通过将多个rptr和相应的靶点引入同一个细胞，以实现RNA记录的可扩展多路复用。通过引入每个DNA目标的多个副本，来记录单个细胞中的RNA。

由来自空肠弯曲杆菌CG84-21的CJ8421_04975基因编码的异源转录本与两个设计的Rptrs中的一个在大肠杆菌中进行了组成性表达进行测试。通过三种不同方法进行测序发现每个设计的Rptr和相应的DNA靶标，批量测序在靶标内产生了几乎完全的编辑。通过对其他外源转录本的表达与检测，表明TIGER可以用来记录不同RNA转录本的存在。

扩展TIGER用于扩展目标选择，SNP检测和定量记录




为了提高TIGER方法的检测序列范围，研究人员通过在目标中引入C，提高TIGER编辑窗口的准确识别，并发现若C位于碱基编辑器rAPOBEC1胞苷脱氨酶结构域首选序列T的下游，引入的不匹配不会显著影响编辑。TIGER还可区分单个核苷酸序列的差异检测单核苷酸多态性（SNPs），研究发现点突变位置对于SNP RNAs的记录有显著影响，当点突变距离靶标的PAM-近端较近时 SNP RNAs减少。除了区分单核苷酸多态性，TIGER还可量化相对转录水平，以测量转录模式的变化。

内源性瞬时单细胞程序的记录




研究人员利用L-鼠李糖诱导大肠杆菌的糖代谢中rhaB转录本的表达，验证TIGER对细胞中异质性表达的捕捉，通过荧光转录报告器证实了l-鼠李糖诱导rhaB的双峰表达，通过流式分选及集落测序发现来自高荧光群体的菌落进行了完全编辑，低荧光群体的大多数菌落没有进行编辑，表明TIGER可以记录单细胞现象。

瞬态和多路RNA记录




研究人员在验证TIGER可以捕捉单细胞中发生的相关变化后，他们利用D-木糖诱导产生的分解代谢及运输基因的表达来验证TIGER对多个基因表达的记录能力，发现其均可产生可测量的记录，表明TIGER可以记录来自不同信号通路中的多个转录本。

记录动员的抗生素耐药性和感染诱导的sRNAs




在建立TIGER的能力后，作者将该技术应用于两个应用领域:记录在记录期间进入细胞的非原生转录本，以及记录关键细胞事件中内源性转录本水平的变化。他们应用TIGER记录了编码磷酸转移酶基因hygR的偶联质粒，该基因对氨基糖苷类湿霉素具有抗性。记录hygR转录本的大肠杆菌细胞与携带可移动hygR质粒的大肠杆菌混合以促进结合。检测到不同程度的编辑，编辑的范围反应了不同个体的结合时间，揭示了可移动遗元素的传播。

先前的研究表明，在细胞内的沙门氏菌46中，PinT和OmrB这两个sRNAs被上调。PinT和OmrB分别是沙门氏菌毒性程序和肠杆菌科细胞表面重塑和运动的关键转录后调节因子，他们应用TIGER成功记录到PinT和OmrB这两种sRNA的表达，表明TIGER可以记录细胞内病原体中感染诱导的sRNAs，为在感染过程中跟踪单细胞反应铺平了道路。

本文作者利用重编程设计的Rptrs通过TIGER方法记录单个活细胞中表达的RNA，并且表明该方法可以记录多个选定的转录本。提供相对转录水平的定量分析，检测SNP，确定表达的强度和持续时间，捕捉单细胞现象，提供细胞转录历史的详细解读。作者应用该方法成功检测到了大肠杆菌中可移动遗传元件的传播过程以及细菌病原体在宿主中的传播路径，指出该方法的基本机制可能扩展到真核细胞，将其应用于跟踪单个细胞的细胞分化、健康和疾病中的RNA编辑事件。随着进一步的改进，TIGER有望为将过去的转录事件纳入当前的观察开辟新的途径。

教授介绍




亥姆霍兹RNA感染研究所Chase L. Beisel博士是亥姆霍兹RNA感染研究所的小组负责人。Beisel博士在爱荷华州立大学(Lowa State university)获得化学工程学士学位，在加州理工学院(California Institute of Technology)获得化学工程博士学位，并在美国国立卫生研究院(NIH)获得细菌遗传学博士后奖学金。他的研究小组专注于为非模式细菌开发遗传工具。这些工具主要基于CRISPR-Cas免疫系统，并已应用于基因组编辑、基因控制和序列特异性抗菌剂。

参考文献
Jiao, C., Reckstadt, C., Knig, F. et al. RNA recording in single bacterial cells using reprogrammed tracrRNAs. Nat Biotechnol (2023).

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