生物分析 | 生物标志物——补体(Complement）检测的生物学 ...

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一、补体
1919年诺贝尔生理学或医学奖获得者Bordet，他发现当把血清加热到56℃的时候，尽管血清中的抗体还没有受到破坏，仍能与抗原发生相互作用，但却丧失了捕杀细菌的能力。Bordet由此推断，血清中一定含有某种迄今还没有被发现的成分，这种成分对热敏感、非常脆弱，而且极其微量，但可以作为抗体的补充使其能够与细菌发生作用从而消灭细菌。他将其称为防御素，后来被命名为“补体”。

目前已知补体是由30余种可溶性蛋白、膜结合性蛋白和补体受体组成的多分子系统，故称为补体系统(Complement System)。

补体系统激活的三条途径，如图1所示。1. 经典途径（Classic Pathway），从C1q-C1r2-C1s2开始，抗原-抗体复合物为主要激活物；2.旁路途径（Alternative Pathway），从C3开始，其不依赖于抗体；3.凝集素激活途径（MBL Pathway），通过甘露聚糖结合凝集素（Mannan Binding Lectin, MBL）糖基识别。上述3条途径具有共同的末端通路，即膜攻击复合物的形成及其溶解细胞效应。表1为3条途径异同点及生理学意义。




图1  补体系统激活的三条途径




二、临床前药物研发中检测补体的重要性
补体检测：一类是治疗药物虽然不是直接靶向补体因子，但是其药理药效作用的结果可能对补体系统的稳定造成影响。例如常见的抗体类药物具体Fc效应片段，当其未结合抗原时，补体识别位点被掩盖，当其结合抗原时，补体识别位点被C1q捕获，激活补体系统。在正常动物中，如果药物导致补体的异常激活，有可能引起Ⅲ型超敏反应。补体的检测可以作为解释药理药效以及毒副作用的重要指标。

另一类，治疗药物直接靶向补体因子，这些药物有Eculizumab，Raculizumab，Narsoplimab，Avacopan等，主要为补体抑制剂。这类药物主要用于治疗罕见病和自身免疫性疾病[10]。补体的检测可以直接表征药物是否发挥效用。

除此之外，对于临床前的动物实验，当动物表现出潮红、寒战、发热、心动过速、高血压、呼吸困难、恶心、呕吐及晕厥甚至死亡时，补体指标的检测可以作为一项推断原因的证据之一。

除了药物本身会引起补体稳态变化外，有文献报道，一些药物的辅料或递送系统，也可能带来急性免疫毒性的风险，表现为超敏反应(HSR)。通过经典途径和旁路途径激活补体，产生C3a和C5a过敏毒素，引起“补体激活相关假性过敏”(CARPA)。这类药物包括放射造影剂 (RCM)、脂质体药物（Doxil、Ambisome和DaunoXome）和含有两亲性脂质的胶束溶剂（例如，Cremophor EL，紫杉醇的载体）[11]。

另外，近年来，脂质纳米颗粒（LNPs）也显示其在RNA疫苗和疗法中作为递送系统的实用性[12]。而LNP又有潜在的引起CARPA的可能。因此目前热门的mRNA-LNP药物以及LNP-CRISPR基因治疗药物比较倾向检测补体指标。

三、补体不同组分检测的意义
因为补体有经典、旁路和MBL三条途径，而每条途径具有异同点。所以选择检测补体的哪种组分需要根据试验的研究目的精心考虑。

3.1 CH50
为了观察经典途径总补体活性的变化，可以选择CH50的检测，它是指给予50%红细胞裂解时所需的补体量。

传统的溶血测试试验中，通常利用抗体致敏绵羊红细胞（EA）作为激活剂，触发经典补体途径，使用分光光度法测定溶血百分比[1]。而使用ELISA试剂盒检测时，利用抗体夹心法（单克隆抗体+TCC+抗体-HRP）测定末端补体复合物（TCC）的含量，间接表征溶血水平。因为TCC本身直接致溶血，而溶血水平直接又表征TCC含量。其结果可以CH50单位当量/毫升 (CH50 U Eq/mL)表示。

ELISA试剂盒的检测主要步骤分为：
1）补体激活。利用热聚集γ球蛋白与样品和对照品一起孵育(37℃孵育1小时)，经典途径被激活并产生TCC。≤-20℃可储存14天。
2）样品稀释（1:200）。
3）测定生成的总TCC。

CH50的检测意义：总补体活性的变化，通过间接反映TCC的浓度来指示样本中末端补体途径的状态。对疾病的诊断和疗效观察具有重要意义。

3.2 C3a
在补体经典途径中会产生3个过敏毒素：C3a，C4a，C5a。其中C3a在经典，旁路或MBL途径的激活过程中均可产生。研究证明，C3a能够增加血管渗透性，有致痉挛性和趋化性，并且诱导从多种类型细胞中释放药理学活性介质。C3a在革兰氏阴性细菌败血症、创伤、缺血性心脏病、脑缺血、透析后综合征和几种自身免疫性疾病（包括类风湿性关节炎、红斑狼疮和急性肾小球肾炎）的炎症反应发病机制中的作用都有很好的文献记录[2-5]。

C3a是分子量较低（约9kD），包含77个氨基酸的蛋白质片段。本身寿命很短，它会被血清酶羧肽酶N快速代谢转化为更稳定的76个氨基酸形式C3a-desArg（C3a C端脱精氨酸形态）。

通常试剂盒利用抗体夹心法（单克隆抗体+C3a+抗体-HRP），检测C3a所有形式的总和。

C3a的检测意义：为研究补体激活途径的作用或者状态，监测体内或者体外C3a的产生是非常必要的。

3.3 C5a
在正常情况下，经典、旁路或MBL途径的激活导致形成的C5转化酶多分子酶能够将C5裂解成C5a和C5b。作为最有效的补体过敏毒素，C5a具有许多生物学功能，包括肥大细胞脱颗粒，释放炎症介质（和IgE抗体引起的I型超敏反应类似），趋化、白细胞隔离以及通过与C5a受体2（C5aR或CD88）结合的细胞活化。研究表明，高水平的液相和吸附的C5a与某些人的血液不相容性有关，尤其是在体外回路中。研究还发现C5a水平与多种疾病状态的发病机制相关，包括心肌梗死、中风、以及血管、泄漏综合征和相关的肾损伤。C5a在疟疾和其他传染病以及败血症发病机制中的作用也有充分的文献记载[6-7]。

同样的，C5a是分子量较低（约9kD），包含74个氨基酸的蛋白质片段。C5a会被血清酶羧肽酶N快速代谢转化为更稳定的73个氨基酸形式C5a-desArg（C5a C端脱精氨酸形态）。

通常试剂盒利用抗体夹心法（单克隆抗体+C5a+抗体-HRP），检测C5a所有形式的总和。

C5a的检测意义：C5a是末端补体复合体的重要组成部分，具有多种功能作用。为研究终末补体途径激活的作用或者状态，需要监测体内或者体外C5a的产生。

3.4 Bb
Bb是旁路途径的特有组分。在特异性抗体缺乏的情况下，通过补体旁路途径，为人体提供了对抗微生物侵袭的保护[8]。旁路途径激活过程中的一个重要反应是因子B（93Kd）转化为活性蛋白水解酶C3bBb。反应示意图如下图2所示。





图2  旁路途径激活过程



研究表明，尽管旁路途径被认为主要发生在缺乏特异性抗体的情况下，但是也会出现很多经典途径激活后进而激活旁路途径的情况。例如，自身免疫性疾病患者中存在的免疫复合物可以触发经典的补体途径激活，产生C3b片段。这些C3b分子能够结合因子B并启动其裂解为Ba和Bb片段。因此，有抗体介导的自身免疫疾病可引起旁路途径的激活，显著增强补体激活并伴随组织破坏。

Bb的检测意义：通过评估测试样本中的Bb含量，可以估计所采样本在该时间点时的旁路途径的利用程度。

3.5 SC5b-9
末端补体复合物（TCC，SC5b-9）是经典、旁路或MBL途径激活补体系统而得到的殊途同归的结果。膜攻击复合物（MAC）是TCC的一种形式，是一种稳定的复合物，介导与补体激活相关的不可逆靶细胞膜损伤。在缺乏靶膜的情况下形成的C5b-9复合物与自然发生的调节性血清蛋白结合，例如S蛋白，形成稳定状态的SC5b-9。

一般试剂盒检测，通过针对TCC的C9环的单克隆抗体与SC5b-9结合，然后加入 靶向SC5b-9抗原的单克隆抗体与HRP络合物。

SC5b-9的检测意义：通过测定TCC的浓度来指示样本中末端补体途径的状态。膜攻击复合物,在其浓度异常升高时,表现出细胞毒性。

四、ELISA平台检测各类补体能力
目前基于ELISA平台，主要使用商品化试剂盒来检测补体，常见的补体有C3，C4，C5，C3a，C5a，Bb，CH50，SC5b-9。表2展示的是ELISA平台各补体类型检测能力的部分参数，仅供参考。






五、补体检测中稳定性的考量
天然补体成分（1.经典途径的C1q、C1r、C1s、C2、C4；2. 旁路途径的B因子、D因子和备解素（P因子）；3. 凝集素途径的MBL、MBL相关丝氨酸蛋白酶；4. 补体活化的共同组分C3、C5、C6、C7、C8、C9。）和总溶血补体活性的定量通常用血清样本进行。相比之下，体内产生的补体激活产物的测量需要血浆样本，因为血清中可能会发生快速的体外激活。血清中活化产物的基线浓度显著高于血浆中的浓度。

在ELISA分析中，体外补体激活的影响因素有：时间、温度、抗凝剂（EDTA、柠檬酸盐和肝素）。乙二胺四乙酸（EDTA）能有效结合钙和镁，从而阻断补体的经典途径和替代途径，在抑制体外活化方面比柠檬酸盐和肝素更有效，尤其是抑制终末通路的激活。因此，EDTA血浆通常被推荐用于补体活化测定。另外，研究表明，当温度升高并随着时间的推移，血浆中存在的抑制作用会被消除。因此为避免体外活化，最重要的是样品保持恒定低温。

综上所述，对于补体激活产物的检测，建议样品的采集遵循以下原则：将血液样品直接采集至含有EDTA的管，并立即放置4℃条件下，血浆应立即分离并储存在4℃，最长需在8小时内储存在-70℃下冷冻，冷冻状态下3年内不会发生明显的激活[9]。检测时尽量避免反复冻融。

六、结语和展望
生物标志物通常是指能被客观测量和评价，反映生理或病理过程，以及对暴露或治疗干预措施产生生物学效应的指标。生物标志物的检测可广泛地应用与病人的筛查、诊断、临床研究、指导用药、预后等领域。根据功能特点的不同，可将与药物研发相关的生物标志物分为以下六种类型：
1.诊断性生物标志物。
2.预后性生物标志物。
3.预测性生物标志物。
4.药效学生物标志物。
5.安全性生物标志物。
6.监测性生物标志[13]。

然而，同一生物标志物可能具有不同功能属性，因此在不同的应用背景下，同一生物标志物的归类可能不同。补体作为生物标志物之一，在包括抗肿瘤药物研发过程中，具有重要的药效，安全和监测等方面的意义。

随着包括ASO，mRNA-LNP等核酸类药物，以及CAR-T，CAR-NK等细胞疗法类药物的不断发展，也将会伴随更多新的生物标志物的出现，以及传统生物标志物又将会扮演什么样的角色，我们拭目以待。药明康德生物分析部也在持续累积经验，不断挖掘新的能力，更好地赋能客户，加速新药研发进程，助力全球医药事业发展。我们始终秉承“做对的事，把事做好”的核心价值观。
参考文献：
[1] Mayer, M.M. Complement and Complement Fixation. In: Kabat E.A., Mayer, M.M., eds. Experimental Immunochemistry. 2nd ed. Springfield: Charles C Thomas, 1961:133-71.
[2] Purwar, Rahul, Miriam Wittmann, Jorg Zwirner, Martin Oppermann, et al. 2006. Induction of C3 and CCL2 by C3a in Keratinocytes: A Novel Autocrine Amplifi cation Loop of Infl ammatory Skin Reactions. J. Immunol. 177: 4444-4450. 7.
[3] Mack, W.J., A.F. Ducruet, Z.L. Hickman, M.C. Garrett, et al. 2007. Early plasma complement C3a levels correlate with functional outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 61(2):255- 60; discussion 260-1. 8.
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[5] Marcheix, B., Michel Carrier, Catherine Martel, Marieve Cossette, et al. 2008. Eff ect of Pericardial Blood Processing on Postoperative Infl ammation and the Complement Pathways. Ann. Thorac. Surg. 85:530-535. doi: 10.1016/j.athoracsur.207.08.050.
[6] Ren-Feng Guo et al. “In vivo regulation of neutrophil apoptosis by C5a during sepsis.” J. Leukoc. Biol. 80(6) (2006): 1575-1583. 24.
[7] Ward, Peter A. “Role of the complement in experimental sepsis.” J. Leukoc. Biol. 83(3) (2008): 467-470.
[8] Ratnoff, W.E., Fearon, D.T., and Austen, K.F. The role of antibody in the activation of the alternative complement pathway. Springer Semin. Immunopathol. 1983; 6:361.
[9] T. E. MOLLNES, P. GARRED & G. BERGSETH, Effect of time, temperature and anticoagulants on in vitro complement activation: Consequences for collection and preservation of samples to be examined for complement activation. Clin. Exp. Immunol. 73, 484-488.
[10] Ricklin D, Mastellos D C, Lambris J D. Therapeutic targeting of the complement system [J]. Nature reviews. Drug discovery, 2019.
[11] Szebeni J. Complement activation-related pseudoallergy: a new class of drug-induced acute immune toxicity [J]. Toxicology, 2005, 216(2-3): 106-121.
[12] Eygeris Y, Gupta M, Kim J, et al. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery [J]. Accounts of Chemical Research, 2021, 55(1): 2-12.
[13] 生物标志物在抗肿瘤药物临床研发中应用的技术指导原则，2021-12
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