RNA m6A甲基化综述

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RNA甲基化是指在甲基转移酶的催化下，RNA的甲基腺嘌呤被选择性地添加甲基基团的化学修饰现象，主要形式为m6A甲基化。m6A甲基化修饰是可逆化的，包括甲基化转移酶（Writers）、去甲基化酶（Erasers）和甲基化阅读蛋白（Readers）等共同参与。与人类的发育，免疫，肿瘤生成和转移，干细胞更新，脂肪分化等过程息息相关，因此，RNA甲基化已成为科研中一个重要且热门的研究方向。



图1
但是这些修饰只发生mRNA的头部和尾部，关于RNA的内部修饰（internal modification）在许多种类的RNA中都有发生。无论是mRNA还是lncRNA，都大量存在m6A修饰。m6A能够加速mRNA前体的加工时间，加快mRNA在细胞中的转运速度和出核速度。除了m6A，RNA上还存在以下常见的几种修饰，包括m1A，m5C等（图1）。
已知tRNA上发生碱基修饰的比例较高，会有各种各样的碱基修饰行为。tRNA修饰有助于提高翻译效率，维持其三叶草折叠二级结构的稳定性。人类的核糖体RNA（rRNA）上有超过200个碱基修饰位点，而剪切体RNA（spliceosomal RNA）上也有超过50个碱基修饰位点。

什么叫m6A修饰？

如图所示，m6A就是在腺苷6位的N原子上插入一个甲基取代基。



m6A修饰又有什么样的功能呢？

m6A 影响mRNA前体的剪接	m6A调控RNA的核输出
m6A调控mRNA翻译	m6A影响mRNA的稳定性
m6A修饰促进环状RNA翻译	m6A修饰改变可改变肿瘤发展
m6A调控造血干细胞定向分化	m6A调控精子发生

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谁参与了m6A修饰

RNA甲基化修饰约占所有RNA修饰的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是高等生物mRNA和lncRNAs上最为普遍的修饰。目前发现microRNA，circRNA,rRNA, tRNA和snoRNA上都有发生m6A修饰。m6A修饰主要发生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能由“编码器(Writer)”、“消码器(Eraser)”和“读码器(Reader)”决定。“编码器(Writer)”即甲基转移酶，目前已知这个复合物的成分有METTL3，METTL14, WTAP和KIAA1429；而ALKBH5和FTO作为去甲基酶（消码器）可逆转甲基化；m6A由m6A结合蛋白识别，目前发现m6A结合蛋白（读码器）有YTH结构域蛋白（包括YTHDF1, YTHDF2,YTHDF3， YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和 HNRNPC）。



PART.1
m6A甲基化转移酶（Writers）

甲基化转移酶（methyltransferase）也叫Writers，是一类重要的催化酶，能够让mRNA上的碱基发生m6A甲基化修饰。METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1492都属于m6A甲基化转移酶的核心蛋白。这些蛋白并不是各自孤立的，而是会形成复合物（complex）共同行使催化功能。由于酵母和线虫等生物缺少这四种核心蛋白中的一种或几种，所以m6A甲基化修饰属于高等真核生物独有的碱基修饰反应。



结构生物学研究表明，METTL3和METTL14这两种蛋白有关键的催化结构域，两者之间会形成杂络物（hetero complex）。其中METTL3是具有催化活性的亚基，而METTL14会在底物识别上起到关键作用。另外WTAP、Vir以及其他类型的factors也是杂络物的重要组成部分。其中WTAP在招募METTL3和METTL14起到十分重要的作用。这些蛋白无论在体内（in vivo）还是体外（in vitro）都会一起对腺苷酸进行甲基化修饰。除了人和小鼠等哺乳动物，果蝇、酵母甚至拟南芥中也发现了类似的同源蛋白（homologous protein）。

PART.2
m6A去甲基化酶（Erasers）

在真核生物中，已发现的m6A去甲基化酶主要包括FTO和ALKBH5等。FTO蛋白全称Fat mass and obesity-associated protein，属于Alkb蛋白家族中的一员并且与肥胖相关。1999年，FTO基因首次在小鼠中被克隆。2007年，三项独立的队列研究分别证实当FTO基因产生突变时，会增加肥胖的风险。同样在小鼠模型中，FTO被敲除或过表达都会显著改变小鼠的体重。2011年，芝加哥大学何川教授在全球首次证实，无论是在DNA还是RNA中，FTO蛋白都是一种十分重要的去甲基化酶。



FTO蛋白在核心结构域上与Alkb蛋白家族相似，但是C端独有的长loop与Alkb家族其他蛋白有所不同。正是这种特有的结构域使得FTO蛋白能够对发生甲基化的单链DNA或单链RNA进行去甲基化修饰。一旦FTO基因转录水平发生异常，会引起多种疾病如急性髓细胞白血病等。ALKBH5是另一种重要的去甲基化酶，能够对细胞核中的mRNA进行去甲基化修饰，在N端有丙氨酸富集区和独有的卷曲螺旋结构（coiled-coil structure）。在细胞系中敲低ALKBH5后，mRNA上m6A修饰水平显著上升。PART.3
m6A甲基化阅读蛋白（Readers）

发生m6A修饰的mRNA想要行使特定的生物学功能，需要一种特定的RNA结合蛋白——甲基化阅读蛋白，也叫reader。RNA pull-down实验已经鉴定了多种阅读蛋白，包括YTH结构域的蛋白、核不均一核糖蛋白（hnRNP）以及真核起始因子（eIF）等。这些阅读蛋白的功能主要包括特异性结合m6A甲基化区域，削弱与RNA结合蛋白同源结合以及改变RNA二级结构从而改变蛋白与RNA的互作。



具有YTH结构域的蛋白包括YTHDC1-2和YTHDF1-3等。YTHDF1-3主要在胞浆中特异性识别m6A修饰的mRNA，而YTHDC1-2的作用部位主要在细胞核内。这些蛋白都在C端有YTH结构域，并且能够与m6A motif有重叠从而介导RNA特异性结合，而脯氨酸/谷氨酰胺/天冬酰胺富集（P/Q/N-rich）结构域则与亚细胞定位有关。eIF3蛋白能够与RNA 5’端UTR上发生m6A修饰的碱基相结合，从而促进mRNA的翻译。这是一种几乎独立于传统的eIF4的激活翻译起始的新机制，RNA在eIF3的作用下招募43s核糖体在5’端Cap形成蛋白复合物。HNRNPA2B1作为hnRNP家族蛋白中的一员仍然能行使阅读蛋白的功能。与YTHDC1蛋白不同的是，HNRNPA2B1与m6A修饰的碱基不能直接结合。HNRNPA2B1除了激活miRNA初级体（pri-miRNA）下游通路外还与miRNA前体（pre-miRNA）加工有关。



植物中RNA是否也存着m6A修饰呢？
与哺乳动物一样，植物RNA也存在m6A修饰。大约在40年前，已经有国外的课题组首次在小麦、燕麦、胚芽鞘和玉米的RNA中发现m6A修饰。植物也有属于自己的甲基化转移酶（writers）、去甲基化酶（erasers）和甲基化阅读蛋白（readers）。研究表明，m6A修饰被认为在植物胚胎发育中起着关键作用，同时，也参与调节对各种非生物（abiotic）和生物胁迫（biotic stress）的反应。