小知识 | 如何获得一张漂亮的胶图

碧雲居士

琼脂糖凝胶电泳——以琼脂糖为介质，对不同大小的DNA或RNA实现分离的一种电泳方法。将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶，然后倒入胶模中，凝固后将形成一种固体基质。将凝胶置于电场中，在一定pH值下带电荷的DNA或RNA通过凝胶网孔向阳极迁移，迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。
想要获得一张漂亮的胶图，主要和琼脂糖、琼脂糖凝胶浓度、电泳缓冲液、核酸染料有关。那么应该如何选择恰当的产品呢？我们接着往下看！
琼脂糖选择指南

琼脂糖介绍
琼脂糖Agarose，缩写为AG，是海洋红藻细胞壁的碳水化合物结构组成部分。 琼脂糖是一种分子量约为12万的无支链(线性)聚合物，含有800 - 1000个单糖。 琼脂糖链由一种重复的异二糖，即D - 半乳糖和3,6 - anhydro - α - L - 半乳糖，通过β - 1,4糖苷键结合而成。 双糖单位，也称琼脂二糖，通过α - 1,3连接形成了一个链。



琼脂糖的单元结构

琼脂糖溶液加热并冷却后，就会形成凝胶基质。其孔洞直径从50nm-200nm不等，由凝胶浓度控制。温度高于90℃，琼脂糖便会融化，变成无规卷曲。冷却后，两个琼脂糖链形成由氢键连接的螺旋纤维。进一步冷却至胶凝固点以下（通常小于40℃），则会有更多氢键连接形成螺旋束网络，进而形成具有三维网格的凝胶。由于琼脂糖链形成氢键，因此琼脂糖形成的凝胶加热可逆，通过溶解含有目的片段的凝胶，可提取电泳分离出的核酸。



通过加热和冷却改变溶液中琼脂糖的结构

琼脂糖通常通过其凝胶强度和电内渗情况判断质量好坏。
琼脂糖凝胶强度

琼脂糖凝胶性能通常用凝胶强度表示。强度越高，凝胶性能越好。质量较好的琼脂糖强度通常在1200 g/cm2以上（1%胶浓度）。


琼脂糖电内渗

在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除，否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取代电离基团，附着到琼脂糖的多糖基质，造成电内渗（EEO）。电内渗会导致缓冲液中产生正电荷反向离子，它们向负极移动，从而造成与DNA反方向迁移的液流，使DNA的分离效果变差。质量较好的琼脂糖硫酸根含量比较低，通常在0.2%以下；电内渗通常在0.13以下。许多市售的琼脂糖并不好用，是因为商家通过在琼脂糖中加入正电荷基团进行化学修饰，以中和凝胶中的硫酸化多糖，或掺入刺槐豆胶（locust bean gum），这样都会抑制后续的酶反应，不利于实验的进行。
琼脂糖凝胶浓度选择指南

通常来说，DNA片段越小，所需的胶浓度越大；而DNA片段越长，所需的胶浓度则越小。选择合适的胶浓度才能更好的分离片段。

DNA片段长度	琼脂糖浓度
<200bp	>3%
200~700bp	2%~3%
700~1500bp	1%~2%
1500~5000bp	0.7%~1%
>5000bp	<0.7%

电泳缓冲液选择指南

电泳缓冲液为具有缓冲能力的离子溶液，通常电泳缓冲液和凝胶制备缓冲液应相同，以确保有效的导电性同时防止pH值变化。电泳缓冲液的选择取决于样品大小、运行时间和电泳参数设置，其中TAE和TBE是最常用的两种缓冲液。



TAE和TBE的优缺点对比

核酸染料选择指南

核酸在电泳过程中会与核酸染料结合。结合染料后，核酸会在紫外灯下发出荧光，从而指示核酸的位置。目前国内科研实验常见的核酸染料类型有EB、SYBR Green I 、 SYBR Gold 、SYBR safe 、Goldview、GelRed和GelGreen几大类型。
EB是应用较早的核酸着色物质，与单链或双链DNA/RNA高效结合，结合后的复合物在紫外照射下（300 nm左右）会发出明亮的橙红色荧光，从而便于观察。因其便宜、灵敏度高等特点，一直作为琼脂糖核酸电泳最常用的荧光染料。但其具有非常明显的毒性及诱导遗传物质（DNA）突变（致癌）的特性，因此后来出现了多种以安全性为主打的无毒/低毒的核酸染料。



核酸染料比较

从灵敏度、安全性、稳定性来看，Gelred都有着不凡的表现，是实验室琼脂糖凝胶电泳的首选核酸染料。
核酸染料使用方法

通常所购买的核酸染料浓度为10,000×，使用时为1×。
一、胶染法（电泳前染色，用法同EB）
1. 配制合适浓度的琼脂糖凝胶；
2. 用微波炉加热使琼脂糖完全融化；
3. 加入GelRed 使其终浓度为 1× （即 100 mL 凝胶中加入 10 μL GelRed 10,000×水溶液）；
4. 将含有 1×GelRed 染液的琼脂糖溶液倒入胶槽中，插入齿梳，室温凝固；
5. 按照常规方法进行电泳；
6. 用UV 凝胶成像系统观察结果。
二、泡染法 （电泳后染色）
1. 按照常规方法进行电泳；
2. 使用 0.1 M NaCl 溶液稀释 GelRed 染液至 3×染色液（例如将 15 μL GelRed 10,000× 水溶液加入 50 mL 0.1 M NaCl 溶液中）；
3. 将凝胶小心地放入合适的容器中，缓慢加入足量的 3×染色液浸没凝胶，室温摇床孵育 30 min （对于含 3.5~10%丙烯酰胺的聚丙烯酰胺凝胶，需孵育 30 min~1 h，时间随着丙烯酰胺含量增 加而延长。单次使用的 3×染色液可重复使用 3 次左右，室温避光保存）；
4. 用 UV 凝胶成像系统观察结果。
Q&A 核酸电泳常见问题

Q1：胶图条带模糊或弥散是什么原因？如何改善？
A1：
1）电泳条件不合适，电压过低，电泳时间过长。可根据电泳槽大小、凝胶大小和电泳缓冲液类型使用适当的电压进行电泳；
2）电泳缓冲液使用时间过长，缓冲能力下降。建议及时更换新的电泳缓冲液；
3）琼脂糖质量不好或溶解琼脂糖不完全。推荐使用高纯度低电渗琼脂糖，并保证溶解琼脂糖时充分完全溶解；
4）核酸样品降解。建议使用新鲜的样品上样，避免核酸酶的污染；
5）核酸样品纯度差，有蛋白污染或盐离子杂质。可以对样品进行提纯。

Q2：核酸染料使用GelRed，胶图条带弯曲成弧形，原因及解决方案？
A2：
GelRed是大分子结构，在琼脂糖凝胶电泳中会影响核酸的迁移，核酸分子量越大影响越大，因此出现轻微弧形属正常现象。
若弧形严重，影响观测，有如下解决方案：
1) 减少DNA上样量，对于未知浓度的样品，尝试1/2或1/3的常用上样量；
2) 降低电泳电压，建议电压为5-10V/cm，一般是90-120V，最高不超过150V；
3) 胶染法降低GelRed使用浓度，即每100ml琼脂糖溶液里加8-8.5ul GelRed 10,000×水溶液；
4) 将染料预先与Loading Buffer混合，然后混合样品后进行电泳。对于Marker，混匀后，取2ul加入20ul marker中混匀，取5ul上样即可。对于样品，取1ul GelRed加入20ul 6×Loading Buffer中，混匀后，取1ul加入10ul样品中，取5ul上样即可；
5) 选择泡染法，降低染料对核酸迁移率的影响，条带更清晰。胶浓度越高，胶块越厚，所需泡染时间越长；
6) 选择合适胶浓度，较高浓度琼脂糖凝胶对于短片段DNA的分离性能好，而较低浓度琼脂糖凝胶有利于长片段DNA的分离，可依据实际情况选择合适浓度的琼脂糖凝胶进行电泳。

Q3：电泳时条带分离效果不好的原因及解决方案？
A3：
1) 电泳时间过短。建议延长电泳时间；
2) 琼脂糖凝胶问题，制胶不均匀或浓度不合适，会导致电泳异常。建议使用新制备的凝胶，制胶时注意操作中带来的浓度误差。对于大分子量片段，低浓度胶分离效果好；对于小分子量片段，高浓度胶分离效果好；
3) 缓冲液问题。缓冲液需及时更换，避免使用时间过长，缓冲能力下降或引起核酸污染。其次，需检查电泳缓冲液配制是否有误，常用的缓冲液浓度为1×TAE和0.5×TBE，是否将电泳缓冲液母液误当作工作液使用。

Q4：DNA Marker电泳条带模糊什么原因？有何解决办法？
A4：
1) 电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲也多次使用后，离子浓度降低，ph值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果；且电泳液长时间不换可能会产生核酸污染。建议经常更换电泳缓冲液，最好现配现用；
2) 电泳条件不合适：电泳时电压应为5-10V/cm，温度应低于30℃。如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA条带迁移的现象。特别是电压太高易出现缺带现象。电泳过程中会产热，因此电泳时间长容易发生条带模糊；
3) 琼脂糖质量不佳：推荐使用正规厂家的琼脂糖；
4) 凝胶制备时间过长：琼脂糖凝胶需现配现用，空气中放置过久或电泳缓冲液中泡太久都会影响电泳效果，使DNA条带的分辨率降低，不建议使用。琼脂糖在微波炉中加热时间不宜过长，每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造成琼脂糖凝胶浓度不准；
5) 核酸染料效果下降：过期或保存不当会导致核酸染料效果下降，需更换新染料，并注意室温下避光保存；
6) 凝胶系统拍照时没有选择最适合核酸染料的激发波长或曝光参数选择不当。