生物学杂志JSB | 关于无定形碳酸钙ACC的稳定性和添加剂的作用

黯然销魂1912

研究·背景


对蜕前蓝鳌虾胃的研究表明，定形矿物和丁质层在丁质基质上连续沉积和致密化，导致胃局部结构分层。对蓝鳌虾蜕前胃横截进了空间分辨拉曼、X 射线和 SEM-EDS 分析。
结果表明，尤其是机磷酸盐、磷酸烯醇丙酮酸盐 (PEP)/柠檬酸盐和蛋质的丰度在整个器官中并不均匀，是逐层变化。基于这些结果，得出结论，蓝鳌虾胃中的 ACC 稳定作是通过种以上的化合物实现的，不仅仅是这些添加剂中的种。
与纯合成定形碳酸钙（ACC）相，在物样品中，定形相在热学压下也可以更加稳定，形成功能性最终产品，如蓝鳌虾的外骼的无定形钙，不会转化为结晶多态。
据推测，这种现象是由于存在稳定晶相并延迟晶体形成的分试剂造成的。
通过对海洋物骼的研究，提出了泛的此类稳定剂。例如电荷和/或磷酸化蛋质、有机分、外来离（尤其是Mg2+ （Politi 等，2010 年））和特殊分子（Aizenberg 等，1996 年）。
对理条件下合成的碳酸钙或磷酸钙的研究表明，电荷聚合物如聚（天冬氨酸）能够稳定所谓的聚合物诱导液体前体 (PILP) 相（Olszta 等，2007 年） 。PILP 代表度合的结晶矿物相，据信它类似于许多物系统中的定形前体。
研究 · 内容

在这项研究中，我们研究了蓝鳌虾临时储存矿物胃中稳定的定形碳酸钙 (ACC)。蓝鳌虾在蜕过程中需要量的矿物质。因此，某些种类的淡虾有专的储存器。
胃位于胃盘的内层和真表之间(Travis, 1963)，胃盘是专于产胃的器官，位于胃的两侧。胃的先涉及排列较差的层状α-丁质基质的沉积，具有正交定向的较短丁质纤维。
因此，定形矿物以纳的球体形式附着基质上(Travis, 1963)。在此过程中，丁质基质和矿物质颗粒均由胃盘的表细胞分泌。随着胃的成熟，新的矿物沉积在外层，较早沉积的矿物致密化成宏观柱状结构，平于向。
随着时间的推移，层状丁质和矿物质的复合物形成同层的有序结构（Travis，1963），最终在蜕过程中通过组织塌陷进蓝鳌虾胃被吸收。
据推测，在蓝鳌虾体巨中发现的某些蛋质通过在调节矿化（即稳定 ACC）和将丁质附着到矿物质中发挥不同作参与丁质架的矿化。
这些蛋质包括胃基质蛋 (GAMP) （Takagi 等，2000 年）、胃蛋 65 + 75 (GAP65 + GAP75) （Shechter 等，2008b；Glazer 和 Sagi，2012 年）、 CqCDA1 （Yudkovski 等。, 2010)和胃蛋 10 (GAP10) (Glazer et al., 2010)）。
相反，最近的 ss-NMR 研究表明，像磷酸烯醇丙酮酸 (PEP) 和柠檬酸盐这样的有机分，但部分都是机磷酸盐（Akiva-Tal 等 2011),存在于胃中平均最多 18 wt%, 是最有可能稳定胃中 ACC 的候选物。请注意，与Mg2+不同，机磷酸盐不是任何结晶碳酸钙中的替代杂质。
此外，在 ss-NMR （Akiva-Tal 等，2011）中确定的磷酸盐洗脱物的化学环境表明它很好地分散在 ACC 结构内。
然，这些观察结果并不排除多种因素（蛋质、机磷酸盐、有机分）的组合可以协同作以增强胃化 ACC 的稳定性。此外，如之前的作（AkivaTal 等，2011 年；Bentov 等，2010 年）所，考虑到预期的逐层沉积、结构和成分的局部差异，可以为ACC的稳定机制。
为了更好地了解胃矿物的热学稳定性和结构与其物形成历史和的的关系，在本研究中，我们对蓝鳌虾蜕前胃切或横截进了空间分辨分析。
为了获得不同度尺度下胃的完整化学、结构和形态学描述，将拉曼光谱和同步加速器和 X 射线散射 (SAXS/WAXS) 与光学显微镜复制成像、分辨率扫描电显微镜相结合(SEM) 和 EDS 分析。
结果表明，机磷酸盐、丁质、蛋质和柠檬酸盐或 PEP 的结构以及含量显出层间变化。这种分布表明 ACC 的显着稳定性不仅仅受这些化合物中的种控制，是取决于所研究的特定层，涉及不同的稳定剂。
研究 · 结果

*01
以两种不同模式切割的环氧树脂包埋切（平于向（图1A 和 C）和垂直于向（图1B），另请参图1 ），对于透射光显微镜来说是半透明的，从较早沉积的最内层 (i) 到较晚沉积的外部 (e) 部分，揭具有较亮和较暗区域的同环。另个特征是存在与这些同环正交的柱（图 1A 和 C 中的箭头） ( Travis, 1963)。
因此，在切完全垂直于向（图1B 的内部）的情况下，层状结构不明显，柱状组织显为细的点。可以看到这些结构特征与胃的关（较图1A 和图1C），表明从不同年龄的蓝鳌虾中提取的胃之间具有相似的结构组织。
图1

Fig.1. Transmission light microscopy on gastrolith sections, (A + B) Large gastrolith cut in two different modes (see also inset): (A) parallel to the growth direction showing distinct growth lines from the earlier deposited innermost layers (indicated by i) to the later deposited external parts (indicated by e), (B) perpendicular to A, due to the curved shape especially at the external parts of the gastrolith the growth lines are also visible here. (C) A smaller gastrolith (size  2 smaller), cut parallel to the growth direction, (D) Light transmission (in Arbitrary Units) and relative amount of P as measured by EDS as a function of the distance from the external layer (e) after integrating the square area as indicated in (A). The light transmission graph is cut at the outer 100 lm on both sides due to interference with embedding material. Peaks 1, 2 and 3 correspond to regions with low transmission as indicated in A and B. Arrows indicate the stacking of columnar features.

由于切厚度均匀，不透明度的变化可能是由矿物层的不同密度引起的。这也可能是由于样品中的亚微级孔隙率在层与层之间发变化，或者是由于吸收可光范围 (390700 nm) 的有机化合物间歇性沉积。
这些变化可能常显着，如图1A 中所区域的径向积分所，导致散射光强度的 4 倍变化（10-40 AU） （图1D）。P 的化学变化，也显在图1D 中，将在后描述。
*02
为了研究这种不透明度的来源，对在液氮中淬后切割的包埋胃横截进了分辨率 SEM。
由于定形碳酸钙（ACC）具有延展性，因此切割过程本会扰正确的结构表征，因为孔/结构会在表弄脏。通过在液氮中淬材料，矿物变硬，从保留更多的原始结构特征。
对应于在透射光显微镜中观察到的结构，整个横截的初始 SEM 研究（图2A）显胃的中间层和最层呈放射状分布的裂纹，以及较的正交裂纹。
尽管可能是由燥或冷冻过程产的，但这些裂缝表明胃结构内部的机械薄弱区域或具有不同热膨胀系数的材料。在透射光显微镜图像中，裂纹也部分沿着胃中间较暗层的位置延伸（图2D ）。
图2

Fig.2. Scanning electron microscopy and EDS maps of a gastrolith cross-section. (A) Scanning electron microscopy, (B) C and P maps, (C) Ca and O maps, (D) overlay of a transmission light microscopy image with SEM and P + C maps. The squares in A and B indicate the positions of Figs. 3 and 4.

在这，它们似乎与较暗层和周围透明区域之间的界有关，这将通过以下段落中讨论的化学分析更加清楚（图 2B ） 。
由于裂纹的尺远于光学显微镜中较暗的区域，并且这些区域中只有部分与 SEM 中的裂纹相关，因此，排除了裂纹是造成这种不透明度差异的原因。
*03
在更的放倍数下（图 3 和4），除了最内层，整个胃都观察到亚微的球形特征。正如献所预期的那样，在后来沉积的胃外层中，这些球体早期沉积的内部部分（图3B）更松散且融合程度更低（图3A），球体从多数区域为150 nm （图3A） 190 nm （图3B）。
在这，可以在球体周围观察到直径约为 5 nm 的松散丁质纤维并从裂缝中伸出（图3C）。同样在胃中间的裂缝周围（图4），球体显出异常松散的堆积，粒径范围从略于平均平（区域 a：140 nm）到异常的球形颗粒（b：265 nm） , c: 440 纳)。
的独球体之间较少的互连可以解释为什么胃在这个位置破裂。此外，在区域 a 和 b 之间，我们看到量含有丁质纤维的有机物质，它们似乎将两种的球体分开。
图3

Fig.3. High-resolution SEM imaging (A) loose packing of spheres (153 ± 20 nm), (B) compaction of spheres (190 ± 27 nm) showing a high degree of agglomeration, (C) single chitin fibers (d  5 nm) sticking out of a crack, (D + E) early deposited inner parts showing ordered layers with higher contrast in SEM (D, see inset). These layers contain aligned chitin bundles (E, 10–20 nm thick), coated by a dense or fine granular mineral (size granules 99 ± 11 nm, see arrows). Size is presented as mean diameter ± standard deviation. The position of the layer visualized in E is indicated by the D-sign in D.

到前为，将 SEM 数据与透射光显微复制图像进较，我们可以推断出明暗分层是由松散到更密集或融合的亚微尺球体的交替引起的。朝着图3D中胃的最内部前进，我们观察到多个层（右）与胃主体（左）分离。

在更的层次结构上（图3E），这些分离的层由更细的分层（每 0.5 lm）组成，主要是 10-20 nm 的丁质纤维和位于颗粒状定形矿物之间的蛋质，具有平均粒径约 100 nm（参箭头图3E）。
丁质纤维相对于后来沉积的外部部分的尺增加可能表明它们被矿物质或蛋质覆盖。同样在胃的主体中（图3D 左侧），我们观察到由散射电强度的变化指的交替分层，其中各层之间的间距在 2 和 3 lm 之间（另请参插图3D）。
*04
为了在空间上解析胃的组成，先使能量散 X 射线光谱 (EDS) 进元素分析。碳 (C)、磷 (P)、钙 (Ca) 和氧 (O) 的图谱在图2B 和 C中给出。
这最引注的是磷的分布（图2B），显出明显的浓度最值胃的些径向分布层，对应于透射光显微镜中的较暗层（另请参图1 和 2 D）。
连同胃中间球形特征的松散堆积，其中 P 含量似乎最（图4），这表明磷含量与纳球抗聚集稳定性之间存在相关性。然，层的年龄似乎也在这发挥作，在后来沉积的外层中，球体松散堆积，尽管这的 P 含量常低。
图4

Fig.4. Close up of the phosphate rich (I) and phosphate poor (II) regions in the middle o the gastrolith by EDS and high-resolution SEM. (I) and (II) indicate regions left and right of the crack. Size of the spheres in sub-regions a–d: (a) 137 ± 17 nm, (b) 265 ± 49 nm, (c) 437 ± 68 nm and (d) 243 ± 31 nm. Sphere size is presented as mean diameter ± standard deviation. Scale bar in I and II is 1 lm.

图4 进步告诉我们，在胃中，球体和磷酸盐含量之间没有直接相关性，因为富含磷酸盐区域（尤其是 a、b 和 c）的尺范围略于平均值（140 nm，a ) 到常的粒 (440 nm, c)。
最后，在区域 II 和磷酸盐块之间看到的 P 的突然变化表明成分的逐步变化，对应于矿物的层状沉积。
*05
该数据表明丁质和矿物的周期性沉积，在早期沉积层中密度更，正如之前观察到的那样(Travis, 1963)。
此外，虽然仅在嵌式中观察到较胃的切（在图1C 中），同步加速器度 X 射线散射 (SAXS) 在样品的内部密集部分显斜率为 2，直到 q = 0.3 nm1（图 5 ） 。
图5

Fig.5. SAXS analysis on a small gastrolith. Radially integrated SAXS data from a late deposited external and earlier deposited inner part of the gastrolith (numbers (1and 2, respectively) are taken at positions shown in inset) fitted with the form factor of 4.6-nm cylinders (i.e. chitin fibers) and 4.7-nm thick plate-like structures (i.e. layers of chitin fibers).

尽管堆积常紧密，斜率为 2 表更像板状的结构（Glatter 和 Kratky，1982） ，并且对应于薄丁质层（由厚度为 4.7 nm 的板安装）的这种有序分布，在致密的碳酸钙（图5），假设丁质和矿物质之间的密度差异够。
有趣的是，外层的 SAXS 模式在 0.9 nm 左右显出个驼峰 1可以安装直径为 4.6 nm 的圆柱体（图5 ）。这种结构对应于这些区域中单个丁质纤维的存在，因此与我们的 SEM 观察结果致。
*06
其他 EDS 图（图2B-D）告诉我们 P 中的最值似乎对应于 C 中的最值， Ca 和 O 在整个胃中分布更均匀。这种趋势表明在这些位置存在浓度的机磷酸盐（ P 代替 C），量磷酸化蛋质或有机分的存在反会导致 C 增加和 Ca2+减少。
为了更详细地研究成分，对相同的胃横截进了拉曼光谱线扫描（图6A 和 B）。光谱数据如图6A所。
图6

Fig.6. Raman-line scans, (A) Raman spectra taken at six different coordinates (3–80) as indicated in the picture (left top) + assignments of the various peaks, (B) Intensity of the Raman peaks as a function of spectra number for orthophosphate and corresponding P-EDS data (left top), carbonate and corresponding C-EDS data (right top),chitin + aromatic protein + PEP/citrate(left bottom) and non-aromatic protein + chitin (right bottom), (C) Statistical correlations between the different Raman Peaks, peak 1(orthophosphate) vs. peak 7 (orthophosphate) (left), peak 6(chitin) vs. peak 18 (aromatic protein) (middle) and peak 5 (protein) vs. peaks 16 + 17 (proteins+ chitin) (right).

些峰的积分（图6B）揭了从较晚沉积的外层（光谱编号 3）到较早沉积的内层（光谱编号 80）的组成趋势。
拉曼光谱分析表明，富磷区域实际上主要含有碱性机磷酸盐 (PO4 3)，这可以从 960 cm1 (m1 PO4 3)处的主信号位置以及在 440 cm1 (m2 PO4 3) 和 600 cm1 (m4 PO4 3)处存在不太强烈的振动（图6B 和 C）。
*07
事实上，PO4 的分布常符合 EDS 中的 P 分布，其中最强烈的信号与机碳酸盐的减少致，PO4平在 1 到 30 mol% 之间变化（表1 ）。

表1

Table 1 Estimation of phosphate in sample using Raman area evaluation.Calculated based on area ratio and ICP data of the synthetic P-containing ACC(ACCP).

此外，主要的 30 cm1 ）和碳酸盐（宽度m1磷酸盐（宽度m1 PO4 28 cm1 ）信号的宽度证实了晶性质。
*08
这种 CO3也可以从同步加速器 X 射线散射 (WAXS) 数据中得出结论嵌的样品（图7）。
在这，与胃中的位置关，所有矿物都显出常相似的定形衍射成，最由两值个在 宽22 的nm 斯左形右 带（AMO1 1和31 nm1 。和 AMO2） 然，在组使斯仔细拟合波段后，我们可以观察到，在胃中 EDS 显较 P 浓度的相同位置，22 nm1 处的拟合峰位置移动到较低值（图7B，AMO1 左轴之和间图的7C，右积轴）。比向较同低时，值AMO2 移动（图和 7B，右轴）。
这种为，其中 WAXS 图案的形状取决于 P 浓度，可以通过较 WAXS 来解释胃的图案与合成纯 ACC 和 ACP 的 WAXS 图案（插图，图7A）。此处，AMO1 和 AMO2 的位置以及两个峰之间的积在 ACC 和 ACP 之间明显不同。例如，ACP 的 AMO1在 ACC 的 AMO 1 (22.2 nm1) 更低的 q 处具有最值 (21.6 nm1) 。
此外，ACP 的 AMO2 远不如 ACC 的 AMO2 显着，导致 AMO2/AMO1 率对于 ACP 为 0.6，对于 ACC 为 1.2。对于体巨，WAXS 模式从贫磷区到富磷区的转变对应于从更像 ACC 的模式转变为更像 ACP 的模式，这也表明这是由样品中机磷的增加。
图7

Fig.7. WAXS analysis on two cross-sections of embedded gastroliths showing, (A) the radially integrated WAXS pattern where the inset (A) shows the XRD diffraction pattern of a synthetic ACC and ACP, (B) the position of AMO1 (black) and ratio between AMO2/AMO1 (red) as a function of the distance from the outermost external layer and (C) the corrected area of the chitin (11 0) signal and P-intensity as measured by EDS as a function of the distance from the outermost external layer. Dashed lines show the correlation between the P-rich regions in EDS and the decrease in AMO1 positionand AMO2/AMO1 ratio in both samples. (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)

拉曼光谱还揭了有机成分的多种信号。此处，丁质信号在胃的晚期外层最为强烈，在接近较早沉积的内部时逐步降低（图6B）。
它的趋势类似于可以指定给芳族氨基酸（苯丙氨酸、氨酸、酪氨酸）的信号（图6B 和 C），这并不奇怪，因为虾中的甲壳素纤维被描述为被这些蛋质包裹着会费（Iconomidou 等，2001 年）。
此外，它的趋势似乎与机磷酸盐相反，但这并不适于所有样品。使嵌样品的 WAXS 数据，我们能够通过测量整个胃横截中丁质 (11 0) 峰的强度并将其除以散射强度的总积（图7C）。
从这些结果中我们还可以观察到，胃由富含丁质和缺乏丁质的区域组成，但不定是从内部到外部区域的丁质含量增加，或随着磷酸盐浓度的变化增加。
在外层的拉曼光谱中，观察到 786 cm1 处的信号（图6A）。该信号可以分配给 PEP 和/或柠檬酸盐的主峰（De Gelder 等，2007 年），这两种成分都被描述为胃中 ACC 稳定的可能候选者（Sato 等，2011 年；Akiva Tal 等，2011 年）。
对应于这项研究（Akiva-Tal 等，2011）， PEP 和/或柠檬酸盐的浓度似乎很；此外，我们的研究表明，它们的分布与机磷酸盐的重叠有限（图6B）。851 cm1 处的信号可归因于芳族氨基酸，如丝氨酸。
观察它的趋势，以及 2880 和 2940 cm1 之间的烷基区域的趋势，它们似乎在胃最古沉积的最内部部分完全重合（图6B和 C）。

在分析胃等物样本时，个体样本之间存在很差异。如前所述，胃是通过丁质基质的沉积和随后由球形矿物颗粒矿化该基质形成的，球形矿物颗粒由邻近的钻孔上细胞排出。
重复此过程以在结构中形成连续的层(Travis, 1963)。尽管胃在整个过程中的形成式似乎相似，但沉积的矿物颗粒的组成却以不同的式发变化。
发现磷酸盐是蓝鳌虾外骼的必需成分，于产类似珐琅质的（Bentov 等，2012 年） ，且还存在于外骼的其余部分中（Sato 等， 2011)，种更复杂的控制胃内磷酸盐含量的信号策略也可能是种选择。然，这可能过度解释了胃的作，因为它只代表于蜕的矿物质总量的部分（Travis，1963).然，由于单个胃内的这些成分变化，单个胃之间的差异可能是巨的。
考虑到虾的年龄（虾的蜕周期要短得多）及其饮造成的差异时，尤其如此。这最值得注意的是，尽管存在这种巨的差异，但胃内的矿物在所有情况下都是常稳定的定形矿物。
除了得出结论，很明显，宽范围的磷酸盐浓度会导致类似的稳定性，我们的拉曼结果表明，即使在胃外层中没有可检测量的磷酸盐，仍然存在稳定的定形碳酸钙。然，在这我们确实看到了存在磷酸烯醇丙酮酸盐 (PEP) 和/或柠檬酸盐的证据，它们也被讨论为胃中 ACC 的稳定剂（ Sato 等，2011 年；Akiva-Tal 等，2011 年）。
该结果表明可以使不同的稳定剂逐层稳定定形碳酸钙。此外，由于尺限制和磷酸盐或柠檬酸盐/PEP 的存在的组合，100-200 nm 的颗粒不会结晶是完全可以理解的。
研究 · 结论

然，在胃中，我们观察到即使在这些颗粒聚集成lm 的棱柱特征的地，矿物仍然是定形的。在这些主要是早期沉积的内部区域中，我们确实通过 SEM 和 SAXS 看到了致密的丁质纤维/蛋质层。
这样的结构不仅对应于献中描述的富含 GAMP 的层（Takagi 等，2000），但可能打开了良好讨论的体巨蛋途径，在矿物质和丁质基质之间形成联系和/或稳定定形矿物质。
此外，这些蛋质与丁质架之间所描述的相关性可以解释在早期沉积的内层中，SEM 中观察到的表观丁质纤维尺增加到 10-20 nm（图 3E），以及增加拉曼中的蛋质含量向这些层前进（图6B）。
通过使空间分辨分析，我们发现蓝鳌虾胃在不同层之间的组成差异很，反映了机磷酸盐、蛋质含量、丁质或柠檬酸盐或 PEP 等分数量的变化。
由于胃中到处都存在稳定的定形矿物，因此除了 ACC 本体之外，特定层中这些添加剂中的些不存在或存在表明稳定胃 ACC 涉及的不是种是多种。

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原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jsb.2014.11.003