NEB @ 你，合成生物学技术盘点（一）- 常用技术荟萃

阿丽66

基因和蛋白被视为合成生物学的基本构件，对其进行重新设计和/或以新方式组装以探索新的有用功能已成为合成生物学的目标。近来生物化学和生物燃料的生产进步，以及对最小基因组的研究，都得益于合成生物学。这些研究通常要对多个 DNA 进行有序组装以构建大型的人工合成 DNA，合成生物学方法的不断进步已大大简化了这些步骤。
NEB 现有多款产品适用于 DNA 组装和克隆。本期盘点将为您揭秘 NEB 提供的合成生物学和 DNA 组装产品解决方案。
<hr/>NEBuilder ^{} 高保真 DNA 组装（NEB #E2621）

NEBuilder ^{} 高保真 DNA 组装预混液可实现精准的 DNA 片段连接，甚至当 5’- 末端和 3’- 末端有不匹配序列。试剂盒通过使用新型高保真聚合酶来实现简单快速的无缝克隆。NEBuilder ^{} HiFi 是 DNA 组装和克隆的首选。
NEBuilder ^{} HiFi DNA 组装


<hr/>NEB ^{} Golden Gate 组装（NEB #E1601，NEB #E1602）
起源于 1996 年的 Golden Gate 组装技术可对 DNA 片段进行高效无缝组装。该技术利用 IIS 型限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶的分步或同步作用，将多个插入片段组装进载体骨架。自这项创新性技术出现后，Golden Gate 已经实现单片段插入、为构建文库克隆来自不同来源的片段以及多模块组装。NEB 提供完成复杂组装所需要的全部产品，并能确保高效和准确性。目前已证实 NEB ^{} Golden Gate 产品可以完成 20+ 片段的组装,准确性 >90% 且背景值很低。
应用 NEB ^{} Golden Gate 进行复杂组装


<hr/>Gibson 组装 ^{} （NEB #E2611）
Gibson 组装 ^{} 是在等温条件下，单管反应实现多个带重叠末端的 DNA 片段的组装，反应不会引入无关序列（无缝组装）。Gibson 组装 ^{} 预混液包含三种不同的酶，且在同一缓冲液中均有活性。将组装好的、完全连接的质粒转化到感受态细胞。整个操作，从组装到转化，只需不到两个小时。
<hr/>USER ^{} 酶 （NEB #M5505，NEB #M5508）

USER ^{} 酶法可对多个 PCR 片段进行组装、改变核苷酸序列以及进行定向克隆。利用 PCR 技术扩增目的基因和克隆载体，使其末端带有 6 - 10 个同源序列。PCR 引物在近同源区 3’ 末端需含有一个脱氧尿嘧啶基团（dU），PCR 引物也可包含核苷酸的替换、插入和/或缺失序列。使用该引物扩增载体和目的基因，使其产物末端带有同源序列且加入了一个脱氧尿嘧啶基团（dU）。接着用 USER ^{} 酶处理 PCR 产物，USER ^{} 酶会在脱氧尿嘧啶基团（dU）处切割形成单核苷酸缺口，形成两端带有单链突出的片段，最终完成无缝定向克隆到线性化载体中。多片段组装和/或各种突变可在一次实验中完成。
用 USER ^{} 酶或热敏 USER ^{} II 酶进行 DNA 组装


<hr/>BioBrick ^{} 组装（NEB #E0546）

利用 BioBrick ^{} 合成生物学方法，DNA 片段（如：编码蛋白质、启动子、核糖体结合位点等的片段）已被标准化，每个质粒都含有一个上述 DNA 片段，在每个 DNA 片段两侧有完全相同的限制性酶切位点。这些酶切位点不会出现在 DNA 片段的编码序列中。通过引入标准化的末端，可以任意定向连接组装成新的“组件”。通过选择不仅可形成互补序列，并且连接后，原识别位点不复存在的酶切位点，将 DNA 片段组装到一起。原有的末端又可用于下一轮组装。尽管每次连接都会引入额外序列，并且组装一个“组件”还需要多轮操作，使得该方法存在局限性，但该方法已经用于设计和构建各种各样有创意的质粒系统。
<hr/>NEB 提供基于Builder ^{} HiFi DNA 组装、NEB ^{} Golden Gate 组装、NEBGibson 组装 ^{} 、USER ^{} 酶学法组装以及 BioBrick ^{} 组装等多种方法学的种类齐全的工具试剂，全心全意助力于您的合成生物学和 DNA 组装研究！