NEB @ 你，合成生物学技术盘点（三）- 无缝克隆实验干货集锦

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“无缝克隆”方法是一种新型克隆解决方案，其突破了很多现有克隆方法的局限，可在质粒的任何位点进行一个或多个目的 DNA 片段的插入，此过程没有序列依赖性且可实现无缝组装。无缝克隆可有序组装多个片段，组装不受序列限制且不引入额外序列，这为合成生物学工作提供了强大的技术支撑，如克隆整个代谢操控子或全基因组重建。
<hr/>NEBuilder ^{} 高保真 DNA 组装（NEB#E2621）

多种商业化的无缝克隆产品，如 NEBuilder ^{} 高保真 DNA 组装试剂、NEB Gibson 组装 ^{} 试剂，工作原理如下：PCR 扩增目的基因；核酸外切酶消化插入片段和载体的 5’ 末端产生单链 3’ 突出端；连接酶、重组酶或体内修复作用形成磷酸二酯键来共价连接插入片段和载体。这些技术能在载体的任何位点进行单插入片段的快速组装，且不引入额外序列，因此备受青睐。
NEBuilder ^{} 高保真 DNA 组装克隆方法概览


与 Gibson 组装相比，NEBuilder ^{} 高保真 DNA 组装 (E2621) 的适用性更加广泛：

• 能够对含 5' - 端和 3' - 端错配的 DNA 片段进行组装；
  
• 用单链 DNA 寡核苷酸片段桥式连接 2 个双链 DNA 片段。
  

观看下方视频，了解 NEBuilder ^{} 是如何用单链 DNA 寡核苷酸片段桥式连接 2 个双链 DNA 片段的。


https://www.zhihu.com/video/1616093285449154561
在整个无缝克隆实验过程中，引物设计是非常重要的一环。在确定了要组装的各个片段的序列信息后，下一步通常要做的就是通过 PCR 进行组装片段的扩增了。为了解决研究者们引物设计的问题，NEB 在线上推出了引物设计工具 NEBuilder ^{} Assembly Tool。NEBuilder ^{} 组装的引物设计推荐登陆 nebuilder.neb.com，使用 NEBuilder ^{} Assembly Tool。


https://www.zhihu.com/video/1616093502642835456
看了上面的视频，想必大家对如何用 NEBuilder ^{} Assembly Tool 在线进行组装片段的引物设计有了更为清晰的认识。那么，小编相信在您设计好自己要组装的各个片段后，NEBuilder ^{} Assembly Tool 是可以帮您快速进行片段扩增引物的设计，助力于您的合成生物学研究的。
<hr/>实验分享

此外，小编也为大家整理了 NEBuilder ^{} 后续实验过程的一些实验 tips，分享如下：
（一）组装反应

• 直接将组装片段克隆到载体时，组装片段的摩尔浓度应比载体浓度高 2-3 倍。
  
• 组装 4-12 个片段时，每片段需设计 25-30 bp 的重叠区域，以提高组装效率。组装反应中使用的每种片段量为 0.05 pmol/片段。
  
• 组装 1-3 个片段时，温育 15 分钟即可。组装 4-6 个片段时，建议温育时间为 60 分钟。通常温育时间不要少于 15 分钟。
  

（二）反应体系及条件
使用前，将试剂完全振荡混匀并置于冰上。
1. 冰上建立反应体系：


{\color{red}{*}}  载体用量 50-100 ng、插入片段量为载体用量的 2 倍时，组装效率最好。插入片段小于 200 bp 时，插入片段的用量至少为载体用量的 5 倍。未纯化的 PCR 片段的体积不应超过组装反应总体积的 20%。
{\color{red}{**}}   为达到最佳组装效率，在等摩尔的每个片段之间设计 ≥ 20 bp 的重叠序列（建议：每个片段 0.05 pmol）。
{\color{red}{***}}   对照试剂可完成 5 次实验。
{\color{red}{****}}  如果组装更多的片段，需增加反应体积，同时增加 NEBuilder 高保真 DNA 组装预混液的用量。组装 2-3 个片段，50℃ 条件下，在热循环仪中反应 15 分钟；组装 4-6 个片段，50℃ 条件下，在热循环仪中反应 60 分钟。反应结束，将样品置于冰上或 -20℃ 保存，用于下游转化。
2. 组装 2-3 个片段，50℃ 条件下，在热循环仪中反应 15 分钟；组装 4-6 个片段，50℃ 条件下，在热循环仪中反应 60 分钟。反应结束，将样品置于冰上或 -20℃ 保存，用于下游转化。
注意：某些情况下，反应时间延长到 60 分钟有助于提高组装效率。