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作为一个生物相关专业的学生：经常有一些搞不懂的生物学常识18-基因敲除

• 如何设计基因敲除的引物？
  要设计基因敲除的引物，可以使用CRISPR-Cas9技术。具体步骤如下：
  在NCBI等数据库中搜索并找到TM9SF2基因的序列，包括外显子和内含子。
  选择sgRNA（single guide RNA），即用于诱导Cas9核酸酶与靶基因DNA结合的RNA序列。在选择sgRNA时应该优先选择靠近外显子的序列，以便更容易诱导基因剪切。
  设计合适的引物，可以使用在线工具如“CRISPR Design Tool”、“CHOPCHOP”等。
  克隆引物到CRISPR-Cas9表达质粒中，这种质粒一般包含Cas9核酸酶和sgRNA序列。
  将表达质粒导入目标细胞，如HEK293T或U2OS细胞，使Cas9和sgRNA与TM9SF2基因相结合并进行切割。
  利用PCR和测序技术验证基因是否被敲除。
  需要注意的是，设计引物时应该确保其特异性，即只作用于目标基因而不影响其他基因的表达。同时，还需要考虑引物的长度、GC含量等因素，以确保引物的稳定性和可靠性。
  
• 如何选择/选择sgRNA
  sgRNA是一种人工合成的RNA分子，用于CRISPR-Cas9系统中的基因编辑。以下是选择/设计sgRNA的几个因素：
  靶向位点：sgRNA需要靶向到要编辑的基因上。通常选择靶向于编码外显子或关键的功能区域，如启动子、剪切位点等。可以使用在线工具或软件来筛选靶向位点。
  特异性：sgRNA的靶向位点必须是具有特异性的，以避免不必要的剪切。可以通过比对基因组序列来确认sgRNA的特异性。
  效率：sgRNA的效率决定了基因编辑的成功率。设计时需要选择高效的sgRNA，可以根据sgRNA的序列特征和经验选择。
  免疫原性：sgRNA需要在细胞中表达，因此需要避免选择免疫原性强的序列，以防止触发免疫反应。
  off-target效应：sgRNA的靶向位点不一定是唯一的，有时会存在off-target效应。因此，需要评估和监测off-target效应并最小化其影响。
  总的来说，选择/设计sgRNA需要考虑多个因素，通常需要进行多次筛选和验证。在实验中应该尽可能选择和使用可靠的sgRNA。
  
• 合成引物时需要加入NGG吗？
  对于CRISPR-Cas9系统，sgRNA需要含有一个20nt的目标序列（即指向目标基因的序列）以及一个PAM序列（一般为NGG）。PAM序列位于目标序列的3'端，用于提供Cas9结合和切割的位置。因此，在设计sgRNA时需要确保目标序列和PAM序列都被包含在内。
  
• 设计时需要包含在内，合成时呢，也需要吗
  在合成引物时，如果是针对CRISPR-Cas9系统的sgRNA引物，一般不需要特意添加NGG序列，因为这个序列是CRISPR-Cas9系统需要识别的底物，会由细胞自身的机制提供。不过，在设计引物时需要确保sgRNA序列的末端必须是NGG，这样才能被Cas9酶识别并切割靶序列。如果是PCR引物，则不需要添加NGG序列，因为这个序列在PCR扩增过程中并不起作用。
  
• PCR引物外侧需要加入酶切位点吗？
  加入酶切位点可以方便后续的克隆和鉴定，但并非必须的。如果您计划将PCR产物克隆至某个载体中，包含酶切位点可以方便您进行限制性内切酶切，使得克隆更为便捷。另外，加入序列标签或者序列修饰也可以提高PCR产物的鉴定效率和准确性。
  对于sgRNA的PCR引物，一般情况下不需要在引物外侧加入酶切位点。因为sgRNA的长度一般比较短（20nt左右），引物长度也较短（一般在20-24nt之间），而且sgRNA的序列比较特殊，没有内含酶切位点，因此不需要加入酶切位点进行克隆。当然，在一些特殊的情况下，如果需要将sgRNA克隆到特定的载体中，可以在引物的5'端或3'端加入相应的酶切位点。
  
• sgRNA有几条引物？
  sgRNA通常需要设计两条引物，一条是上游引物，一条是下游引物。这两条引物用于扩增出一个含有sgRNA序列的DNA片段，通常称为sgRNA载体。该载体用于转化细胞，并产生能够靶向基因组的CRISPR-Cas9复合物。在CRISPR-Cas9系统中，sgRNA的功能是将Cas9酶引导到靶向的基因组区域，并在该区域产生DNA双链断裂。因此，正确设计的sgRNA引物对于实现基因编辑非常重要。
  
• 上下游引物有什么作用？
  在基因组编辑中，如CRISPR/Cas9技术，需要设计一对引物来扩增靶向基因的DNA序列，这对引物通常被称为上下游引物。上游引物位于靶向序列的上游，下游引物位于靶向序列的下游。
  上下游引物的主要作用是扩增出需要靶向的DNA序列，使其可以被CRISPR/Cas9系统进行切割。同时，这对引物的长度、特异性、双端结构等都需要精心设计，以确保引物只扩增出需要编辑的DNA序列，并且在后续的实验中表现出良好的稳定性和可重复性。
  
• sgRNA有几条引物？
  sgRNA通常需要两条引物来扩增：前向引物和反向引物。这两条引物可以在CRISPR-Cas系统的靶向序列上分别的两侧，用于扩增整个sgRNA序列。通常情况下，前向引物在sgRNA序列的5'端，而反向引物在3'端。在扩增时，这两条引物结合在一起，形成一个完整的sgRNA序列。
  
• sgRNA的两条引物在合成时需要怎么样？
  sgRNA通常由两条引物组成：前引物和后引物。这两条引物用于扩增目标DNA序列，然后通过连接适当的序列，形成最终的sgRNA。
  在合成sgRNA的过程中，需要将前引物和后引物分别合成，并在两者的末端加上相应的序列。通常，前引物的末端需要添加T7启动子序列（5'-TAATACGACTCACTATAG-3'），而后引物的末端需要添加转录终止序列（5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3'）。这样，合成后的sgRNA序列就可以被T7 RNA聚合酶转录为RNA分子，用于靶向基因组中的特定区域。
  需要注意的是，在设计前和后引物时，需要确保它们能够选择性地扩增目标区域，而不会扩增其他区域，以避免误靶效应。此外，前引物和后引物的长度也需要适当调整，以确保PCR反应的特异性和效率。
  
• 这两个引物分别都需要碱基互补配对的反向序列对吗？
  是的，sgRNA的两条引物都需要和模板DNA的反向互补序列配对。通常情况下，sgRNA设计中给出的“上游引物”和“下游引物”就是这两条引物。需要注意的是，在实验室中进行sgRNA合成时，这两条引物通常需要分别合成，并在PCR反应中同时使用。此外，由于sgRNA设计中引物序列较短，有时会加入一些“spacer”序列来增加引物长度和特异性，从而提高PCR扩增效率和特异性。
  
• 两条引物合成时需要分别合成正向和反向的，以便于后期正反向的引物连接在一起的对吗？
  是的，通常在设计和合成sgRNA时，需要分别合成正向和反向的引物，以便于在后期将它们连接在一起。这样可以避免在连接过程中出现不必要的错误和不必要的浪费。在连接过程中，需要将两条引物通过PCR扩增出一个完整的sgRNA序列。
  
• 使用infusion可以吗？
  可以使用In-Fusion（或叫Gibson Assembly）方法将两条PCR产物连接在一起，这种方法常用于构建质粒或基因敲除/过表达载体。In-Fusion方法基于同源重组原理，将两条PCR产物的端部互补配对，由外切酶或DNA聚合酶完成连接。这种方法具有操作简便、无需使用限制性内切酶、高效等优点，因此在分子生物学实验中得到了广泛应用。
  
• 说的是gRNA的引物可以吗
  使用Infusion可以合成gRNA的引物，但是具体取决于Infusion试剂盒的适用范围和操作步骤。需要注意的是，在设计gRNA引物时，需要考虑到引物长度、引物结构和特异性等因素，以确保gRNA的特异性和效率。在实验中，可以采用不同的方法进行gRNA引物的合成和验证，以确定最佳的引物组合。
  
• 使用什么试剂能将grna的引物连接在一起呢，以便于和载体相连接？
  连接gRNA的两条引物可以使用PCR扩增的方法来连接在一起，然后使用DNA连接酶（如T4 DNA连接酶）进行连接。另外，也可以使用基因克隆方法，如In-Fusion Cloning或Gibson Assembly等。这些方法都可以将gRNA的两条引物连接在一起，并将其与载体进行连接。
  
• 一般是使用几个质粒来进行基因敲除呢？
  一般情况下，基因敲除实验需要使用两个质粒。一个质粒用于携带Cas9蛋白基因，另一个质粒携带目标基因的sgRNA序列。这两个质粒在同一细胞中共同作用，Cas9蛋白与sgRNA结合，介导DNA双链切割，从而实现基因敲除。当然，在一些特殊情况下，也可能需要使用多个质粒进行基因敲除。
  
• 比如使用慢病毒三质粒系统，都包括哪些质粒，如何进行基因敲除？如何进行筛选基因敲除成功的？
  慢病毒三质粒系统包括以下三个质粒：
  pMD2.G：携带VSV-G表达序列，用于包装病毒。
  psPAX2：携带Gag、Pol、Rev等表达序列，用于产生转录后病毒粒子。
  lentiCRISPRv2：携带Cas9表达序列和gRNA模板序列，用于基因敲除。
  下面是使用慢病毒三质粒系统进行基因敲除的一般步骤：
  设计gRNA序列，克隆到lentiCRISPRv2质粒中，获得敲除质粒。
  将pMD2.G、psPAX2和lentiCRISPRv2质粒一起转染到包装细胞中，以产生转录后的病毒粒子。
  收集病毒粒子，用于感染目标细胞。
  筛选敲除细胞。一般来说，可以通过PCR、Western blotting或克隆测序等方法验证目标基因是否被敲除。
  
• 如果要筛选基因敲除成功的细胞，可以使用下面的方法：
  使用PCR检测目标基因的敲除。根据gRNA设计引物，对细胞进行PCR扩增，验证目标基因是否被敲除。如果PCR产物的大小与预期不符，就说明目标基因被敲除。
  使用Western blotting检测目标蛋白的表达。根据目标基因编码的蛋白性质，设计合适的抗体，用于Western blotting检测目标蛋白的表达。如果目标蛋白的表达受到显著抑制，就说明目标基因被敲除。
  对克隆进行测序检测目标基因的敲除。将PCR产物克隆到质粒载体中，对克隆进行测序，验证目标基因是否被敲除。如果测序结果显示目标基因发生了插入或缺失，就说明目标基因被敲除。
  
• 如果使用慢病毒三质粒系统进行假病毒包装的话，都包括哪些质粒？该如何包装，有详细步骤吗？该如何检定假病毒的包装效果？
  慢病毒三质粒系统包括以下三个质粒：
  载体质粒（Packaging plasmid）：该质粒包括慢病毒外壳蛋白、包装序列和转录启动子等元件，用于包装病毒基因组和产生假病毒。
  助包装质粒（Helper plasmid）：该质粒包括慢病毒产生所需的辅助元件，如转录因子和酶等。
  目的基因质粒（Expression plasmid）：该质粒用于将目的基因导入靶细胞中。
  以下是慢病毒三质粒系统的包装步骤：
  将慢病毒载体质粒、助包装质粒和目的基因质粒转染至包装细胞中。
  收集细胞培养上清液（supernatant），通过超速离心或过滤等方式去除细胞碎片和杂质，获得假病毒颗粒。
  使用光谱扫描仪或荧光定量PCR等方法检测假病毒包装效率。
  纯化假病毒颗粒，去除未包装的质粒和其他污染物。
  使用滴度测定法（titering）确定假病毒颗粒的感染力。
  在慢病毒包装的过程中，需要注意以下几点：
  不同的细胞系对慢病毒包装的效率不同，需要选择适合的细胞系。
  包装质粒的浓度和比例需要进行优化，以达到最佳的包装效率。
  慢病毒包装过程中需要避免污染和交叉感染，建议在无菌条件下操作。
  假病毒包装后应该在低温下保存，并且尽可能快地使用。
  
• 所以慢病毒载体质粒名称叫什么名字？
  慢病毒载体质粒有很多种，常用的包括pLVX、pCDH、pLenti等，不同的实验室或者研究者可能会选择不同的载体。
  
• 这三种有什么区别呢？
  

这三种慢病毒载体质粒的主要区别在于其表达载体中的启动子和选通子的来源和类型，以及其带有的标签和荧光蛋白的类型和数量。以下是它们的一些简要介绍：
pLKO.1：这是最常用的慢病毒载体质粒之一，其中包含人类U6启动子和H1启动子，以及EGFP或RFP等标记物。它是一种经典的RNAi工具，可以用于基因敲除和RNAi研究。
pLenti-CMV-GFP：这是一种基于CMV启动子的慢病毒载体质粒，可以用于高效表达融合蛋白和其他目的蛋白。它带有EGFP标签，可以用于快速筛选成功转染的细胞。
pLVX-Puro：这是一种基于CMV启动子的慢病毒载体质粒，可以用于高效表达目的蛋白和RNAi工具。它带有Puro标记，可以用于快速筛选转染的细胞，并通过药物选择增加稳定表达的细胞数量。