分子生物学整理|基因和DNA笔记（一）

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绪论

（一）分子生物学概念

• 广义，从分子水平试图解释生物学现象的一门科学
  
• 狭义，从分子水平上研究基因结构与功能。
  

（二）主要研究内容

• 基因与基因组的结构——遗传图谱、克隆及测序
  
• 基因功能——突变体与野生型比较，敲除、表达及过表达
  
• 基因表达调控——鉴定启动子、增强子等调控元件；鉴定转录因子等调控蛋白；调控蛋白与调控元件的相互作用
  

第一章 Genes and DNA

（一）概念

• gene 基因是编码 RNA 的 DNA 序列，编码蛋白质的基因通过 RNA 翻译产生蛋白质，指具有明确产物的部分 DNA 的核酸链；它包括前导和跟随的部分（头部和尾巴）， 内含子、外显子。
  
• allele 等位基因是指传代过程中，在染色体的一个座位上有多种可变形式的基因。
  
• locus 基因座是指基因存在于染色体上的特殊位点，等位基因即为基因座上发现的基因的不同
  
• 形式。
  
• genome 基因组是由其体内所有遗传物质组成的一套完全序列。包括染色体和细胞器中的 DNA。
  

（二）DNA 作为遗传物质主要通过三个实验证明

• DNA 是细菌的遗传物质：肺炎双球菌转化实验。（转化：细菌接纳外源 DNA 而引入新的基因标记）
  
• DNA 是病毒的遗传物质： T2 噬菌体侵染实验。
  
• DNA 是动物细胞的遗传物质： TK 基因转染实验。
  

转化：到原核； 转染：到真核； 转导：载体是病毒
（三）DNA 的基本结构

1） 基本单位为核苷酸(碱基 nitrogenous base、五碳糖、磷酸 phosphate)，构成含碱基的糖-磷酸骨架。
2） DNA 为双螺旋结构:

• 碱基间氢键为维持力，符合碱基互补配对原则。
  
• G+C%具有物种异性（26%到 74%），任一DNA的组成可通过 G+C%比来描述。
  
• 双螺旋直径为 20 ，3.4 /bp，形成宽沟与窄沟， 右手螺旋， B 型 DNA。
  

3） 半保留复制： 亲本 DNA 双螺旋两链分开，每一链作为模板合成新的互补链的复制方式。
4） DNA 在复制叉replication fork处分离。 复制叉是双螺旋 DNA 两条亲本链分开使复制进行的部位，在该处存在DNA 聚合酶复合物。

• DNA polymerase 聚合酶：合成子代 DNA 链(在 DNA 模板的指导下)的酶。在修复或复制中涉及。
  
• RNA polymerase：使用 DNA 作为模板合成 RNA 的酶( DNA依赖性 RNA 聚合酶)。
  
• DNAase (DNA 酶)：攻击 DNA 之间化学键的酶。
  
• RNAase：底物为 RNA 的酶。
  
• Endonucleases (内切核酸酶)：切割核酸链内的化学键。可能特异性的切割 RNA 或者单链或双链 DNA。
  
• Exonucleases (核酸外切酶)：从核酸链中每次从一头切割一个核苷酸，可特异性切割DNA/RNA的5'/3'端。
  

5） 核酸通过碱基配对进行杂交 nucleic acids hybridize by base pairing

• Melting temperature (Tm)： 热变性使 DNA 分子双链解开一半所需的温度/吸光值达到最大一半时的温度
  

• Denaturation：从双链转变成单链状态。
  
• Annealing (退火)：两条互补单链配对形成双螺旋结构。
  
• Cot value：复性时 DNA 初始浓度 Co 与复性所需时间 t 的乘积。 基因组越长越复杂，Co·t 值越大（在最初不知道序列时的测量方法）
  
• Filter hybridization (滤膜杂交)：将变性 DNA 样本固定于硝酸纤维膜上，然后用放射性标记的 DNA 或 RNA 进行杂交。
  
• 三大blot（印迹实验）
  
  
  
  • Southern blot：将变性 DNA （限制性内切酶消化）经琼脂糖凝胶电泳后转移到 NC 膜 从而与互补核酸（标记探针）杂交的过程。 通过 Southern blot 分析鉴定基因在基因组中的拷贝数可以发现基因家族。
    
  
  

• Northern blot：将琼脂糖凝胶上的 变性 RNA 转移到 NC 膜上 从而能够与互补 DNA 杂交的技术。
  
  
  
  • 检测的总RNA不用进行酶切，可直接用来跑电泳；Northern blot不使用碱变性，因为碱性溶液会使RNA水解，而是采用乙二醛或甲醛等进行RNA变性
    
  
  
• western blot：免疫印迹法，通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织进行着色。抗体作“探针”，标记二抗作“显色”
  
  
  
  • 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，转移到NC膜上，以非共价键吸附蛋白，与对应抗体起免疫反应，再与酶/同位素标记的二抗起反应，经过底物显色检测电泳特异性目的基因表达的蛋白成分。
    
  
  

（四）DNA 突变

1） 突变类型
根据成因

• 自发突变 Spontaneous mutations： 无任何诱变剂(reagent)加入时发生的突变。 如复制错误、 环境影响等。
  
• 诱发突变 Induced mutations： 加入诱变剂造成的突变。(直接或间接作用)
  
  
  
  • 诱导物 Mutagens：通过与调控蛋白结合激活基因转录的小分子。
    
  
  

根据点突变  SBS： 基因上碱基发生改变

• Transversion (颠换)：指一个嘌呤 purine 被嘧啶 pyrimidine 代替或相反的突变。
  
• Transition (转换)：是一种嘌呤代替另一种嘌呤，或嘧啶代替另一种嘧啶。 （亚硝酸、碱基类似物）
  
• Insertion （插入）：添加一碱基对
  
• Deletion (去除): 除了染色体末端的末端缺失外，两侧的区域是连接在一起的两个统称 idle, 比较长的序列的改变。当几个序列相比，不知道是多了还是少了，只知道有差别
  

根据效应（正失活、逆野生）

• Suppression (抑制)：指降低突变效果而不逆转 DNA 本身变化的突变。
  
• Suppressor (抑制子)： 抑制一个基因座上突变效应的基因座成为抑制基因。
  
• Second-site reversion： 另一个突变可能发生在基因其他部位，它的作用补偿了第一次突变，成为二次回复。
  
• true reversion：原突变的严格逆转。
  
• Back mutation 回复突变: 逆转突变导致基因失活的效果，恢复了野生型。回复体 revertants
  

2） 突变集中于热点
Hotspot (热点)： 突变或重组频率显著增加的位点。
碱基修饰是热点突变的一个主要原因,最常见的为 5-甲基胞嘧啶。（ C→U； Cme→T）

甲基化会使DNA紧密缠绕在染色质上，使基因不易被转录和表达。同时会导致DNA结构改变和DNA损伤积累，导致基因组的不稳定性和热点突变的发生

（五）基因功能

1） 一条基因编码一条肽链。

• Homomultimeric protein (同源多聚体蛋白质)：由相同亚基组成的蛋白质。
  
• Heteromultimeric proteins (异源多聚体蛋白质)：有不同的亚基(不同基因编码)组成的蛋白质。
  

解释显隐性基因：野生型（显性）→产生编码蛋白质；突变型（隐形）→不产生相应蛋白。
2） 互补测验
确定两个突变发生在同一基因还是不同基因，制造一个有两个突变的杂合子。（将两个突变的纯合子与亲本交配）

• cis configuration (顺势构型)：指在同一个 DNA 分子上的两个位点。
  
• Trans configuration(反式构型)：指两个基因座在不同 DNA 分子(染色体)上出现。
  

3） 基因突变会引起功能的丧失或获得（功能角度划分突变类型）



conservative 保守的

• Nonsense mutation (无义突变)：变成终止密码子（UAG、UAA、UGA）
  
• Null mutation (无效突变)：能够完全消除基因功能，通常是由于基因的物理删除导致。
  
• Leaky mutations (渗漏突变)：允许残留水平的基因表达。
  
• Silent mutations (沉默突变)： 不改变基因产物功能的突变。 氨基酸变，蛋白功能不变。
  
• Neutral substitution (同义突变)：蛋白质中不改变活性氨基酸的变化。 三联体冗余性和兼并性， 序列改变， 氨基酸不变。
  
• Missense mutation (错义突变)： 点突变，氨基酸变， 失去原来功能。
  
• loss-of-function mutation（功能丧失型突变）：基因功能消除或减弱。 通常隐性，但不总是
  
• gain-of-function mutation（功能获得型突变）：基因活性提高或者获得新功能。
  

4） multiple alleles 复等位基因：同一条基因的多种变异体，可产生不同的表型。
      Polymorphism（多态性），一个位点可能有等位基因的多态分布，没有单独的等位基因可以被认为是唯一的野生型。
（六）遗传密码

• DNA 序列与相应蛋白质序列的关系称为遗传密码。
  
• 密码子是指三联体核苷酸 triplet ，能够编码氨基酸或终止信号。
  
• Reading frame (读码框架)：将一条核苷酸链以三种三连体形式读出的形式之一。
  
• Open reading frame (ORF，开放读码框)：由编码氨基酸的三联体组成的连续 DNA 序列，能翻译成蛋白质， 包括起始密码子和终止密码子。
  
  
  • 不是所有ORF都能表达出蛋白产物或表达占有优势/生物学功能的蛋白
    
  • 所以CDS(编码一段蛋白产物的序列)必定是OFR(可能多个)，但OFR不一定是CDS
    
  
  
• Frameshift mutations (移码突变)：因非 3bp 整数倍碱基插入或缺失造成的、改变三联体翻译成蛋白质读框的突变
  

（七）基因与蛋白质的关系

1） 基因、 mRNA 和蛋白质都是 共线性关系 colinear ( 三联体核苷酸和氨基酸序列呈 1:1关系 )

A prokaryotic gene consists of a continuous length of 3N nucleotides that codes for N amino acids.
The gene, mRNA, and protein are all colinear.

2） 表达一条基因的蛋白质产物需要几个过程：

• 转录：以 DNA 模板链合成 mRNA 的过程（ Pre-mRNA：初始转录本，用于修饰剪切RNA splicing ）；
  
• 翻译：以 mRNA 为模板合成蛋白质的过程
  

基因分为编码区和非编码区，而真核细胞中编码区又有外显子和内含子；UTR: untranslational region,指mRNA上5'或3'端的非翻译区



内含子是断裂基因中外显子之间的间隔序列(IVS), 可参与前体RNA的转录，但转录的RNA序列于转录后的加工去除，不包括于成熟的RNA分子中

3） 蛋白质呈反式作用而DNA上的位点呈顺式作用
位于同一条 DNA 上的位点称为顺式 cis（DNA 自身）
位于两个不同 DNA 分子上的位点称为反式 trans（基因产物）→扩散因子作用于多个靶点。
cis-acting locus ：只影响处于同一 DNA 分子上的 DNA 序列，此性质通常暗示该位点不编码蛋白质。
顺式突变可以鉴定出反式作用因子识别靶点的 DNA 序列，他们不表达为 RNA 或蛋白质，而且只影响相邻的 DNA 序列。
中心法则描述了遗传信息的基本性质:可以延续和互换的核酸序列复制、转录、反转录,但翻译从核酸蛋白质是单向的,因为不能从蛋白质序列检索核酸序列
4） Retrovirus (逆转录病毒)：是一种 RNA 病毒，通过向双链 DNA 的转变而繁殖。

• Reverse transcription (逆转录)：以 RNA 为模板合成 DNA，由逆转录酶催化。
  
• viroid 类病毒：仅含小的 RNA，不含蛋白质，其 RNA 不编码蛋白质。
  
• Prion 朊病毒： 蛋白质感染性病原体， prpc 通过修饰或构象变化转化为 PrPSc，使其具有蛋白酶抗性。
  

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