小知识 | 基因组DNA提取那些事（一）

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DNA，即脱氧核糖核苷酸，储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。研究DNA一直是分子生物学、遗传学等热门领域的热点，所以提取DNA亦成为实验中不可或缺的一环。常见的DNA提取方法有CTAB法、SDS法、吸附柱法、磁珠法。其他的方法还有物理方式如玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法。化学方式如异硫氰酸胍法、碱裂解法。生物方式：酶法。
CTAB法提取DNA

CTAB（Cetyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，但不会沉淀核酸。再通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后，加入乙醇沉淀，即可使核酸分离出来。CTAB方法主要应用于植物基因组DNA的提取。
CTAB抽提缓冲液配方：2%CTAB，100mmol/L Tris-HCI（ pH 8.0），20 mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCI。有些植物富含多糖多酚，会添加不同浓度的β-巯基乙醇，通常为2%。
CTAB法提取RNA步骤（该流程仅为CTAB法其中一种，实验时可根据不同材料加以改进,以获得最佳实验结果）：
1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。
2）取少量实验材料（约300mg）置于研钵中，用液氮磨至粉状；
3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；
4） 将磨碎液分倒入1.5ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；
5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10min轻轻摇动，30~60min后取出；
6）冷却2min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3min（若提取的是总基因组，则不能剧烈震荡。），使两者混合均匀；
7）放入离心机中10000rpm离心10min，与此同时，将600ul的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；
8） 10000rpm离心1min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；
9）10000rpm离心1min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；
10）60sec后，直立离心管，加入720ul的70%乙醇及80ul 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；
11）放置30min，使DNA块状物的不纯物溶解；
12）10000rpm离心1min后，倒掉液体，再加入800ul 70%的乙醇，将DNA再洗 30 min；
13）10000rpm离心30sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；
14）加入50ul 0.5 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15h，使RNA消解。
CTAB法中各试剂的作用：
1）Tris-HCL(pH8.0)：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
2）EDTA：螯合Mg2+或Mn2+，抑制DNase活性；
3）NaCl：提供高盐环境，使DNA充分溶解；
4）CTAB：裂解细胞，沉淀蛋白和中性多糖；
5）β-巯基乙醇：抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除；
6）氯仿：变性剂，抽提脂溶性物质；
7）异戊醇：去除气泡；有助于分相（使离心后水相、有机相稳定）；
8）异丙醇：沉淀DNA；
9）NaAc：促进DNA沉淀；
10）70%乙醇：洗涤DNA（盐、蛋白等溶于70%乙醇，而DNA不溶）；
11）95%乙醇：沉淀DNA，也可使DNA快速干燥；
12）乙烯吡咯烷酮(PVP)：酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
SDS法提取DNA

SDS（十二烷基苯磺酸钠）是一种阴离子去垢剂，在高温（55-65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析、蛋白变性，同时SDS与蛋白质和多糖结合成复合物，释放出核酸。提高盐浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全，离心后去除沉淀，上清液中的DNA用异戊醇/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。该方法操作简单、温和，也可提取到高分子量的DNA，但得到的的产物含糖类杂质较多。 主要应用于动物组织、血液、细胞、细菌和酵母等基因组DNA的提取。
SDS法提取基因组DNA操作流程（该流程仅为SDS法其中一种，实验时可根据不同材料加以改进，以获得最佳实验结果）：
1）取1-2g实验材料用液氮研磨至粉末状，转移粉末到加有500ul提取液的离心管中，轻轻混匀；
2）向离心管中加入50ul 20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈振荡以防基因组DNA断裂，65℃保温10min，并不时摇动；