LC-MS代谢组学的应用领域和基本流程

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LC-MS代谢组学
代谢组学是一门对生物样本中的代谢产物进行全面分析的学科。在过去的几十年里液相色谱和质谱技术的发展推动了基于LC-MS的代谢组学的指数级进展。靶向和非靶向代谢组学策略是健康和医学领域的重要工具，特别是在疾病相关生物标志物、药物发现和开发、毒理学、饮食、体育锻炼和精准医学的研究方面。临床和生物学问题现在可以从代谢表型的角度来理解。这篇综述重点介绍了目前基于LC-MS的代谢组学分析方法及其在临床研究中的应用
近年来，越来越多的研究致力于“组学”策略，主要是为了更好地理解细胞机制及其生物相互作用。“Omic” 技术包括基因（基因组学）、信使核糖核酸（转录组学）、，蛋白质（蛋白质组学）和代谢产物（代谢组学）。代谢组学是“组学”研究的最新领域，旨在对生物样本（如组织、细胞和人类或动物生物燃料）中的小分子（通常分子量为50–1500Da）进行全面鉴定和定量
由于代谢组学是指对内源性代谢产物、细胞过程的最终产物的研究，因此对全球代谢组学的评估可以揭示代谢产物在生物系统复杂的网络变化。此外，代谢组学还受益于对环境污染、药物摄入、食品添加剂、毒素和其他外源性物质产生的外源代谢产物的评估，进而增加了代谢组的复杂性。在这种情况下，代谢组学已成为一种强大的方法，并广发应用于天然产物、食品科学和营养、环境健康和身心健康、临床、个性化医学和药物发现等。描述代谢物鉴定的研究已经报道了很多年；然而，随着代谢组学迅速扩展，并已成为揭示代谢调控机制的重要手段。
分析平台的创新，包括基于质谱仪（MS，mass spectrometers）和核磁共振设备（NMR，nuclear magnetic resonance equipment ）的硬件以及分离技术和数据分析统计方法，为全面分析代谢物提供可能。此外，用于根据质谱差异分离重叠峰值的去卷积，为处理原始质谱数据的大数据集提供了很大的优势，从而能够获得尽可能多的信息。
代谢组学领域的进步在专门研究这一主题的出版物中得到了反映。过去十年的临床代谢组学中，出版物的指数增长是明显的，如图所示。根据Web of Science数据库，2010年至2020年间，约有5868篇代谢组学相关的科学文章发表，过去5年（2016年至2020年）约占总数的68%。



采用代谢组学和临床为关键词在Web of science 数据库中检索2010-2020间的文章

在临床方法中，代谢组学的主要应用是发现与疾病相关的生物标志物，与对照样品相比，这些生物标志物是改变的代谢产物。这些生物标志物可以帮助临床诊断，根据疾病类型和/或对治疗的反应对患者进行分类，选择适当的治疗反应，并改善对疾病进展的监测。在药物发现中，生物标志物对新药的合理开发和发现以及靶点参与至关重要。此外，在药物毒理学中，代谢组学可用于临床前试验，以验证新化学实体（NCEs）的毒性和有效性。
代谢组学的另一个重要贡献与先天性代谢异常（IEM）或其他代谢疾病患者的研究有关。临床代谢组学也被证明是遗传测试的一种有用和有力的补充，可以作为解释遗传对疾病表型影响的替代方法。
使用从科学网数据库和VOSviewer中提取的数据作为文献计量工具，基于临床代谢组学方法调查的主要疾病的网络数据创建了一张地图。代谢组学研究为不同类型的疾病带来了益处，这些研究集中在肿瘤学领域，包括乳腺癌症，结直肠癌、前列腺癌和癌症，其次是婴儿期和肥胖的研究。此外，肾脏疾病、2型糖尿病和糖尿病等慢性疾病的病例数近年来不断增加。另外，根据世界卫生组织的数据，临床代谢组学在阿尔茨海默病和精神疾病也有一定的应用。



临床基因组学的主要应用领域

代谢组学也是预测冠心病（CHD）的一种很有前途的工具，冠心病是男性和女性死亡的主要原因。自身免疫和传染病在代谢组学中也得到了重视。
代谢组学是如何获得不同疾病过程的机制见解的。将重点介绍目前基于LC-MS的代谢组学分析方法及其在临床研究中的应用。
液相色谱-质谱法：实用方法
液相色谱法（LC）分离
代谢组由各种高达1.5kDa的代谢物组成，具有不同的理化性质和广泛的浓度范围，因此需要一种以上的分析分离技术，以互补的方式加以覆盖。液相色谱-质谱联用（LC-MS）是代谢组学研究最常用的平台之一[20]，主要由于其高分辨率、灵敏度、良好的重复性。
LC和MS之间的耦合对于代谢组学分析很重要，因为之前的代谢物分离减少了由生物基质的复杂性引起的离子抑制，增加了灵敏度。电喷雾电离源（Electrospray (ESI) ionization sources）已被广泛用于代谢组学研究，因为它能产生完整的分子离子或少量片段，促进代谢产物的鉴定。
根据所选择的代谢组学方法，选择不同的质量分析仪与LC系统耦合。
LC中的分离机制基于固定相（SP）和流动相（MP）之间溶质的分子特性和微分平衡，根据极性、疏水性、电荷和分子大小。通常，代谢组学分析的LC分析是使用洗脱梯度进行的，以提高分析物之间的分辨率，特别是在复杂的混合物中，如生物样品中，从而缩短后期洗脱组分的保留时间，从而实现更快的分离和更窄的色谱带，从而实现更有效的分离。
在过去的几十年里，LC柱填料的新技术随着更小颗粒尺寸的发展而发展，无论是全多孔（低于3μm和低于2μm）还是融合核心颗粒，它们都能提供更高的分辨率和更高的效率。
此外，能够承受大于10000psi的压力的超高效液相色谱（UHPLC）仪器，已经证明比传统的高压液相色谱（HPLC）具有更高的分辨率和速度。然而，UHPLC和HPLC系统经常应用于代谢组学研究。近年来，由于LC-MS允许使用相同的仪器进行不同的分离模式，已使其成为代谢组学研究中最通用的分析平台之一。这是通过使用具有不同SP和洗脱模式的色谱柱来实现的。
在大多数应用模式中，反相液相色谱法（RPLC）用于非极性化合物，亲水相互作用液相色谱（HILIC）用于高极性代谢物。
RPLC分离机制是基于化合物在非极性固定相和极性流动相之间的分配。RPLC柱通常由与十八烷基硅烷（C18）或辛基硅烷（C8）碳链化学键合的二氧化硅颗粒载体组成，并用由极性（水性）和非极性（有机）溶剂（如甲醇、四氢呋喃和乙腈）的混合物组成的MP洗脱。连接链越长，固定相的疏水性就越强。梯度洗脱经常使用，尤其是对于复杂的基质，其中MP从高百分比的水相开始，并且梯度强度随着有机相在色谱过程中的增加而增加。根据分析物的疏水性，其中更多的疏水性物种被强烈保留。代谢产物属于有机和脂肪酸、脂质及其衍生物（磷胆碱、鞘磷脂、甘油磷脂、固醇脂质等）、糖、类固醇等通过RPLC-MS进行评估。尽管RPLC已被广泛用于靶向和非靶向代谢组学分析，但这种分离技术的主要局限性之一是离子和高极性化合物的低保留率，这些化合物在柱的空隙体积附近洗脱，使准确的检测和鉴定变得困难。因此，HILIC作为一种与正相（NP）类似的分离模式出现，用于极性分析物的分离，并与RPLC分析互补。
代谢组学可以分为非靶向代谢组学和靶向代谢组学。非靶向代谢组学可以全面、系统地分析源自生物体的所有代谢产物，是一种可以发现新生物标志物的无偏代谢组学分析。靶向代谢组学是对特定代谢产物的研究和分析。两者都有各自的优点和缺点，并且经常结合使用以发现和准确测定差异代谢物的含量，对后续代谢分子标记物的深入研究和分析。非靶向代谢组学和靶向代谢组学参与食品鉴定、疾病研究、动物模型验证、生物标志物发现、疾病诊断、药物开发、药物筛选、药物评估、临床研究、植物代谢研究、微生物代谢研究等诸多领域。
非靶向代谢组学



非靶向代谢组分析流程

靶向代谢组学




靶向代谢组学与非靶向代谢组学之间的比较