分子生物学整理|基因和DNA笔记（二）断裂基因

游戏乾坤

第二章 断裂基因

（一）转录本、外显子、内含子




注意：外显子和内含子是转录本上面的概念，是基于转录这个行为的定义。而5' UTR , CDS 和 3' UTR 区域,是基于翻译这种行为的定义！UTR即非翻译区，是mRNA分子两端的非编码片段。

真核生物（eukaryotic）基因组包含的断裂基因（interrupted gene）由间隔的外显子（exon）和内含子（intron）组成。
内含子：阻断基因线性表达的序列，在pre-mRNA经剪切/修饰后，被切除的DNA序列。
外显子：在pre-mRNA经剪切/修饰后，被保留的DNA部分，并最终出现在成熟RNA的基因中。
RNA 剪切（RNA splicing） ：从初始转录物中剪去内含子的过程。

剪切后，外显子仍按 DNA 中的顺序排列。只有外显子的突变才会影响蛋白质的序列，但内含子的突变会影响 RNA 的剪切，从而抑制蛋白质的产生。

真核生物基因结构

（二）分析真核生物基因组的方法

1. 限制性核酸内切酶（restriction endonucleases）

II 型内切酶可以识别双链 DNA 上的特异性位点（一般为 4-6bp 碱基对序列），从而特异性地打断 DNA 链。

不同限制酶识别的碱基序列一般不同，但切割后所产生的黏性末端可能是一样的，像这种能切割不同的 DNA 片段但产生相同黏性末端的一类限制酶称为同尾酶  如 BglⅡ和 BclⅠ

限制酶识别的序列大多数为回文序列，切割位点在DNA2条链相对称的位置。回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配黏性末端，这样形成的 2 个末端是相同的，也是互补的：



限制酶EcoR I 识别的回文序列及产生匹配粘性末端示意图

在回文对称轴上同时切割 DNA 的 2 条链，可能产生平末端，产生平末端的 DNA 可任意连接，但连接效率较黏性末端低。此外也有识别非对称序列的情况。



限制酶 Hae III 切割DNA产生平末端示意图

酶切条件：较纯的底物DNA、Mg2+、Tris-HCl、37℃

2. 限制性酶切图谱（restriction map）

是 DNA 上用不同限制酶切 cleavage 后切割位点的线性排布（表示 DNA 上以限定长度分开的所有位点的线性次序）。 Sticky ends or blunt ends；表示的是物理距离
物理图谱：利用限制性内切酶将染色体切成片段，根据重叠序列确定片段间连接顺序 ，以及遗传标志之间物理距离。

显示染色体或基因组基因的物理位置和其他感兴趣的 DNA 序列。物理图谱被用来帮助科学家识别和分离基因的位置克隆。单位是碱基对(bp)、千碱基(kb)、兆剪辑(Mb)。

限制性核酸内切酶是DNA作图中的关键工具

（三）断裂基因的组织是保守的

1. 在负选择时外显子序列保守而内含子序列变化多端

比较不同生物的同源基因发现， 内含子的位置通常是保守的，而相应内含子的长度变化较大。

换个角度讲，外显子和内含子中发生突变的频率相同，但是外显子中突变可因不利而被除去，内含子由于缺少编码蛋白质功能所施加的压力从而自由积累碱基的变化。外显子由于编码蛋白质功能，处于选择压力之下，较保守，而内含子没有选择压力，其进化速度要快的多。

基因长度的变化主要取决于内含子长度。
内含子位置保守， 比较不同物种的同源基因相应的内含子的长度可能有很大区别。
*断裂基因在细菌和噬菌体中也存在，但概率很低。
2. 在正选择时外显子序列变化多端而内含子序列保守

正选择（positive selection）即相对于没有突变的同类物种，某一物种上能给予更多优势表型的突变可能导致该物种更加有利的存活。
在处于正选择压力下的基因中，外显子序列变化很大，而内含子序列则保持更高的相似性。
外显子数目保守(外显子通常短小，典型的外显子编码小于100个氨基酸)，但是基因大小改变。
Broths:来源于同一个父辈的兄弟间基因排序是保守的。外显子的排布可以显示出两个是否保守，所以可以反应出两个基因是不是"同一个基因"
（四）通过外显子的保守性可分离基因

外显子的保守性可作为鉴定编码区的基础，即通过确认那些在许多生物体中都存在的序列片段：

• 必须有一个ORF
  
• 在其他生物中很可能存在与之相关序列
  

southern blot

物种杂交（zoo blot）：将来自一定区域的短片段（放射性）作为探针，通过 southern 杂交检测来自不同物种的相关 DNA，如果发现几个物种中的杂交片段与某一探针相关，这个探针就成为一条基因外显子的候补片段。对候补片段测序，如果有可读框，就可用来分离周围的基因组区，如果是外显子的一部分，可以鉴定出整条基因。（利用外显子的保守性）。通过比较正常 DNA 杂交 DMD 患者 DNA，可以找到相关致病基因。




Contig(克隆重叠群)：代表基因组区域的一组重叠的克隆; 由这些重叠的染色体片段组装而成的连续的 DNA 序列

在测序过程中，DNA样品会被随机切割成多个小片段，并通过不同的方法进行测序。这些测序片段会被组装成Contig，通常使用计算机程序进行自动拼接，也可以通过人工检查和编辑来优化Contig的质量。

外显子捕捉（exontrapping）

两段外显子当中夹有一个内含子，在内含子中插入一段我们感兴趣的基因，如果片段中不含外显子，剪切方式不变，否则改变，可被扩增检出。
要求带有一个强启动子载体。如果基因组片段含有一个外显子，其序列可在细胞质RNA中发现，但如果基因组片段中只由内含子序列组成，那么剪接就不会发生，mRNA也不会被运到细胞质中
外显子是进化功能性单位， 很多外显子等同于编码具有独特功能的蛋白质序列。蛋白质通过连续添加适当模块获得新功能。

人类85%以上的疾病基因都由外显子碱基突变造成。

（五）高等与低等生物断裂基因分布比较

• 总体上从低等到高等，基因组变大，断裂基因增多，内含子趋向于变得更大（长度变化范围大），外显子则保持原有大小。
  
• 酵母多含非断裂基因，但在苍蝇和哺乳动物多为断裂基因。
  

（六）可编码一种以上蛋白质的DNA序列

1）overlapping gene

重叠基因（一条基因是另一条的一部分）中使用不同的阅读框可以产生不同的蛋白质。当同一个 DNA 序列被两个重叠基因在不同的阅读框中阅读时，可以产生非同源蛋白序列。

重叠基因（overlapping genes）是指在基因组中存在的两个或多个基因，它们的编码区域（CDS）部分重叠。这意味着它们共享同一段DNA序列，并且可能会产生相互重叠的蛋白质序列。
重叠基因的存在可能会对基因组注释和基因功能预测产生挑战。由于它们共享同一段DNA序列，因此在基因组注释过程中可能会被错误地合并或拆分成多个基因。但也具有一些生物学意义。如可能会产生不同的蛋白质变体，具有不同的功能或表达模式。此外，它们可能会参与基因调控网络中的复杂相互作用，影响基因表达和表型特征。

2）选择性的起始密码子或终止密码子可以产生两个蛋白质，其中一个相当于另一个的片段

如果一个起始密码子被选择，那么该基因会编码一个完整的蛋白质。如果另一个起始密码子被选择，那么该基因会编码一个较短的蛋白质，相当于原蛋白质的一个片段。同样，选择性的终止密码子也可以影响蛋白质的长度和结构。

3）alternative splicing

可变剪切（alternative splicing）是指在基因转录过程中，mRNA前体分子中的不同外显子（exon）和内含子（intron）的组合方式不同，从而产生多种不同的mRNA分子和蛋白质。
可包含或去除一定的外显子，或在外显子中进行选择，产生不同的外显子组合。 可变剪切使蛋白质数目增加，在果蝇和线虫中增加了约 15%，而在人类中这种增幅更大，约 60%的基因具有选择性表达模式。



可变剪接使用相同的前体mRNA，产生的mRNA含有不同的外显子组合

（七）基因家族有共同组织结构

基因家族（Gene family），来源于同一个祖先，由一个基因通过基因复制或者加倍而产生两个或更多的拷贝而构成的一组基因，它们在结构和功能上具有明显的相似性，编码相似的蛋白质产物。
基因超家族（Superfamily）

来自于某一共同祖先的一系列基因， 但在现今却呈现较大差异。（例：豆血红蛋白，珠蛋白，肌球蛋白/大鼠胰岛素基因/不同物种肌动蛋白基因）。变化：

• 内含子变大变小，产生消失
  
• 与其他基因融合，产生新的基因
  

基因同源性的原因

形成 gene family 。通过复增数量变多，但是基因中不允许两个完全相同的基因存在，所以多出的基因会被甲基化或被沉默，所以功能域被保留。看是不是同源基因，需要看组织结构。

• 基因重复（基因复制、染色体重排、逆转录）
  
• 收敛演化（相似环境和选择压力，独立产生相似的形态、结构和功能）
  

重点

连天风火_268

断裂基因在不同物种间存在联系，可能在进化过程中起到重要作用，为基因重组提供灵活性，增加蛋白质多样性。不同物种中的断裂基因在内含子数量、长度和序列上存在差异，反映了物种基因组结构和功能的特异性。植物中的断裂基因通常具有较多的内含子，而动物中的断裂基因内含子数量相对较少。[发呆]