蛋白质组学之样品前处理（下）

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前面我们聊过了蛋白质组学的定性检测与定量检测以及靶向蛋白质组学，今天我们聊聊蛋白质组学中样品的前处理！（此系列课程亦有视频，如有兴趣，可知乎私信我）
接着上一篇文章！
我们收集好样品后，接下来就开始做样品前处理了。它分几步走呢？看下图：


后面会详细聊每一步，这里我们先做点儿背景铺垫，大伙儿心里先有个谱：
铺垫之一：第二步“充分溶解蛋白”尤为重要，如果蛋白没有充分溶解，能提取到的蛋白就会很少，达不到研究目的。
铺垫之二：在第一、二步，即破碎样品和溶解样品的过程中，为了减少人为操作引入的修饰，通常会准备大量的冰，进行冰上的操作。同时还需要加入蛋白酶抑制剂，防止在操作过程中蛋白被样品中自带的蛋白酶降解掉。
说到样品中自带的蛋白酶，尤其要高度重视的是胰腺样品，如果你在室温下解冻，整个样品可以直接化成水。胰腺本身含有非常丰富的胰蛋白酶，在体外的室温环境下，胰蛋白酶的活性没有谁来抑制它，于是可以完全释放天性，把组织样品里的蛋白都分解掉了！所以针对胰腺样品，要非常小心，必须在冰上操作，利用低温环境控制蛋白酶的活性。
铺垫之三：关于第三步“解旋蛋白质”。通常，蛋白质都是成球状的稳定状态，解旋蛋白质就是将球状蛋白中的二硫键打开，让它形成链状结构，以便进行下一步酶切。以下图胰岛素结构图为例，胰岛素分子通过很多二硫键形成稳定的球状结构，亲水基团主要集中在表面，而疏水基因都包裹在里面，如果用特异性酶直接作用于这些球状蛋白，包裹在里面的序列就不容易被酶作用到，酶切的效率就会很低~
如果能将这些二硫键打开，球状结构被破坏，蛋白分子就会变成链状，酶切位点才能尽可能多地暴露在酶环境里，这时候我们再加入特异性酶，就能得到更多的酶解肽段。


铺垫之四：对于第五步去除杂质，其实伴随着整个预处理的过程。杂质都是从哪里来的呢？比如，从组织中带来的杂质，提取溶液、酶解样品中带来的盐等。我们要知道，质谱是一个非常灵敏的仪器，它检测的是多肽的质荷比。所有的盐类，以及所有会进行离子化的杂质，都会干扰到肽段的检测。所以我们会要求进入质谱之前的蛋白样品非常干净。在蛋白水平及肽段水平都会进行去除杂质的步骤。
样品的破碎
好，接下来我们就从破碎样本开始，详细聊聊每一步具体应该怎么做，需要用到哪些方法、工具和试剂，以及操作的技巧和需要注意的那些小细节。
第一步 破碎样品


样品破碎的方法主要分三类：
1、机械碎裂：简单粗暴，把组织研碎，比如骨骼组织，强体力活！
1）液氮研磨：适用于大部分组织样品，比如常见的胃脏样品、肠样品、肝脏样品等。把所有的器皿、研钵，以及样品，都放到-80℃环境下，然后把样品放到研钵里，倒入液氨，整个样品会冻得非常脆，然后就大力研磨，直到磨成粉末；
2）匀浆：适用于亚细胞器的破碎，使用Dunce匀浆器。注意哈，匀浆没有液氨研磨那么剧烈，除亚细胞器以外的蛋白提取，通常还是建议用液氨研磨，破碎得更充分一些。
3） 捣碎法：用研磨的方法破碎样品，如果样品量又大，那可是件非常辛苦的事情！于是一些公司推出了细胞破碎仪，利用玻璃珠或者磁珠剧烈地震荡，或者用刀片高速旋转，总之，用电力代表人力，帮助我们做样品破碎。
2、物理破碎：靠足够大的温差、压力差等方法，导致细胞膜破裂
1）温差法：通常用于含有细胞壁的样品，比如一些细菌样品，利用高温和低温的反复变化，破坏细胞壁。
2）压力差法：适用于组织样品，通过高压和低压的反复变化，实现对组织样品的破碎，
3）超声破碎法：适用于细胞层次的样品
3、化学处理法：使用各种水解酶、变性剂或表面活性剂等，破碎细胞的膜结构，导致细胞的破碎。
事实操作中呢，我们通常会将几种方法结合起来使用。比如先液氨研磨，拿去提取蛋白，检测一下蛋白含量，发现破碎不够充分，于是又再用超声的方法，或者结合比较强的变性剂的方法等等，增强样品破碎的程度，释放更多的蛋白。
说到化学处理法，我们来看看样品前处理中会用到哪些抽提试剂吧。


上面列出的一些重要的试剂，我们来详扒一下：

• 8M尿素：这是比较强的变性剂，有时也会用6M尿素。
  需要注意的是，在加入8M尿素以后，所有处理过程不能超过37℃，否则会将蛋白质的氨基胍基化，影响蛋白质的理化性质，影响后续的酶解，以及质谱检测，后果很严重！另外，如果这一步你用了8M尿素，后面又要用胰酶来做酶解，那么加入胰酶之前，一定要先将尿素稀释到1M，否则高浓度的尿素会让胰酶也变性，失去活性。
  
• 硫脲：能起到助溶的效果，也是一种还原剂，它的还原性与一些试剂盒是不兼容的，比如BCA试剂盒。
  Tips: 处理过程中,我们要注意每一步的溶剂是否与下一步的溶剂兼容（兼容的意思就是，能不能一起使用）。根据它们的兼容性来进行选择。
  
• 4%SDS：很强的去污剂，但与胰酶不兼容，并且很难通过超滤的方法脱去的，它在超滤脱盐的过程中仍保留在蛋白样品中间。对于这类去污剂，我们通常会利用有机溶剂来去除它们，比如丙酮沉淀。
  Note: 这些去污剂，在样品进入质谱前都要去除干净，否则它们会在质谱的电场下离子化，影响我们的分析。因此呢，去污剂要慎用！
  
• 还原剂：功能是打开二硫键，使蛋白分子尽量从球状变成链状，增加蛋白质的溶解性，以及暴露出尽可能多的酶切位点。
  
• 蛋白酶抑制剂：夏天尤其需要，当温度比较高的时候，酶的活性也会较高，蛋白样品很容易发生自降解。如果做特殊样品的处理，比如磷酸化样品或其它翻译后修饰样品的富集，要针对性地加入这一类酶的抑制剂。
  
• 有机试剂：用来沉淀蛋白质，去除杂质。比如前面提到的去污剂，我们就可以利用有机试剂来去除它们；另外，针对植物样品或昆虫样品，样品本身含有很多色素，比如叶绿素，昆虫翅膀上的色素等，也可以用有机试剂将色素溶解掉，然后进行洗涤。
  

特别注意：整个处理过程中，所有使用的EP管、枪头、装试剂的塑料瓶，都尽量用进口的产品，尤其是当使用到强溶解性的溶液！国产的EP管上的材料（聚乙二醇）很容易被这些溶液洗脱下来，进入样品中，并且很难洗脱掉。而聚乙二醇非常容易离子化，会在质谱里形成很强的塑料峰，甚至会完全掩盖目标肽段的峰，造成检测的失败！