改良版 CRISPR 技术可有效治疗小鼠进行性耳聋

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改良版 CRISPR 技术可有效治疗小鼠进行性耳聋是怎么回事，是真的吗？2019年08月09日是本文发布时间是这个时间。下面一起来看看到底怎么回事吧。
                                改良版 CRISPR 技术可有效治疗小鼠进行性耳聋
                               
                                改良版基因编辑技术有效治疗小鼠进行性耳聋，且未见脱靶效应
                               
                               



图片来源：Pixabay

来源  Harvard Medical School
翻译  阿金
审校  严冰冰、李光昭
编辑  李光昭

哈佛医学院（Harvard Medical School）和波士顿儿童医院（Boston Children's Hospital）的科学家们通过一种新型基因编辑方法，成功治愈患进行性听力丧失的小鼠，且治疗后未检测到明显的脱靶效应。

这种新方法于 7 月 3 日发表在《自然·医学》（Nature Medicine）上。该方法优化了传统的 CRISPR-Cas9 基因编辑系统，使其更加精准，能够更好地识别患病小鼠体内的致病突变基因。科学家可利用这一改良工具选择性地关闭听力缺陷基因 Tmc1，同时保留健康的基因拷贝。

研究人员在报告中指出，值得一提的是，该系统成功地在小鼠基因组 30 亿个碱基中，准确识别出了单个缺陷基因。

研究人员谨慎地表示，这样高精准度的基因编辑疗法，可以应用在人类身上之前，还有很多的研究工作需要完成。然而，他们也指出，该研究具有里程碑式的意义，因为它极大地提高了标准基因编辑技术的有效性和安全性。

该研究负责人之一、哈佛医学院布拉瓦特尼克研究所（Blavatnik Institute at Harvard Medical School）的贝塔雷利转化医学教授 David Corey 指出，“我们的结果证明，目前改善过的 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，靶向能力更强，达到了前所未有的识别度和准确度。”


贝多芬突变

每个人都携带同一个基因的两份拷贝，分别来自父母双方。在许多情况下，一个正常基因拷贝足以保证该性状的正常功能，保护个体免于发病。但在显性遗传病中，单个缺陷基因就会导致个体患病。


实验小鼠。图片来源：? filin174 / Adobe Stock

携带错误表达的 Tmc1 基因的小鼠被称为贝多芬小鼠，因为它们的发病过程与著名音乐家贝多芬听力逐渐丧失的过程十分相似。不过，贝多芬耳聋的原因仍然是个谜。

在小鼠体内，贝多芬缺陷的标志是 Tmc1 基因序列的单个碱基错误：碱基 T 被替换为了碱基 A 。一个碱基的变化导致了个体由正常听力到耳聋的病变。在人类中，“贝多芬突变”会导致患者出生后发生进行性听力下降，最终在 25 岁左右发展为严重的耳聋。

关闭或者沉默发生突变的 Tmc1 基因或许可以保护动物的听力，但是，如何在不影响健康基因的前提下做到呢？


双重锁定，克服阻碍

传统的 CRISPR-Cas9 基因编辑系统通过向导分子 gRNA 识别突变的 DNA 序列，目标序列被确定后，DNA 核酸内切酶 Cas9 就会进行剪切。

然而，目前这一技术的准确度不够。这是因为引导 Cas9 核酸酶到目的序列的向导 RNA 分子，及负责切割的 Cas9 核酸酶都无法做到完全精准，可能会导致错误的序列剪切。

为了克服这一难题，研究人员采用了最初由哈佛医学院的病理学教授 Keith Joung，和哈佛医学院的病理学助理教授 Ben Kleinstiver 在马赛诸塞州综合医院（Massachusetts General Hospital）共同开发的技术。该技术使用了改善后的 Cas9 内切酶——取自金黄色葡萄菌（Staphylococcus aureus），而不是传统的酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）。

为了提高检测和剪切的准确性，新的优化系统结合了两个层面的目的基因识别：通过 gRNA 分子确定目的基因，同时通过改良的 Cas9 酶特异性锚定贝多芬小鼠携带的突变基因。这两种识别方式的结合，确保了剪切酶可以只针对异常基因进行精确且有选择性地剪切。

论文的第一作者 Bence Gyorge 说道：“我们利用该系统只识别突变 DNA 而不识别正常 DNA 的特性，使用双重识别系统提高了它的准确性。这一方法在特异性识别突变基因的准确性上达到了前所未有的水平。” Bence 在哈佛医学院学习期间开展了该项研究，如今就职于瑞士巴塞尔的分子和临床眼科学研究所（Institute of Molecular and Clinical Ophthalmology）。

在最初的细胞水平实验中，这一基因编辑技术可以准确识别出突变的 Tmc1 基因（贝多芬突变）和正常 DNA 片段。通过进一步分析显示，在同时携带缺陷性基因和正常基因的贝多芬细胞中，99% 以上的剪切仅发生在有缺陷性基因上。

之后，研究人员又通过内耳注射，对携带贝多芬突变的小鼠和正常小鼠分别进行基因编辑治疗。DNA 分析显示，只有携带贝多芬缺陷基因的小鼠的内耳细胞中发生了基因剪切——再次印证了这一技术的准确性。

为了确认基因编辑疗法不会干扰正常基因的功能，科学家以未携带贝多芬缺陷基因的小鼠作为研究对象，刺激其内耳中的听觉细胞——毛细胞。结果显示毛细胞未受影响，小鼠听力反应正常——确认了基因编辑疗法不会影响正常基因的功能。


让贝多芬突变基因沉默

为了检测该疗法是否在动物体内有效，研究人员进行了听力评估的金标准测试：听性脑干反应，这是一种听觉诱发电位，可以反映出内耳毛细胞实际探测到并传递给大脑的音量。

通常，未经治疗的贝多芬小鼠到 6 个月大就会完全失聪。相比之下，没有遗传缺陷的小鼠可以一直保持正常听力，能捕捉到约 30 分贝的声音——类似于耳语的音量。

以未接受治疗且携带突变基因的小鼠为对照组，贝多芬小鼠的听力情况在接受基因疗法两个月后有显著改善，能听到约 45 分贝的声音——正常谈话音量，或与未接受治疗的小鼠相比，对声音的敏感度提高了 16 倍左右。改善最多的贝多芬小鼠能够听到 25 到 30 分贝的声音，基本与健康小鼠听力水平无异。

综上所述，新的基因疗法有效关闭了缺陷基因的表达，避免了这一导致听力快速丧失的疾病。


David Corey教授（左）和Jeffrey Holt教授（右）
图片来源：Michael Goderre/Boston Children’s Hospital

因为该疾病的特征是进行性听力丧失，所以研究人员对基因治疗进行了为期数月的效果评估。研究人员在小鼠出生之后不久进行治疗，并对接受治疗与未接受治疗的贝多芬小鼠和正常小鼠，进行为期六个月、每四周一次的听力水平测试。未经治疗的贝多芬小鼠在第一个月内可以听到低频声音，但对高频声音表现出明显的听觉损失，六个月时听力完全丧失。与之相对的是，接受过治疗的贝多芬小鼠几乎能正常地听到低频声音，甚至有些几乎可以正常地听到高频声音。

很重要的一点是，未携带遗传缺陷的小鼠没有因基因治疗出现任何听觉损失的现象。这一发现证明了该疗法的安全性及选择性靶向缺陷基因的能力。更鼓舞人心的是，一小群贝多芬小鼠在接受治疗后近一年的时间里，听力几乎稳定保持在正常水平。

因为贝多芬基因缺陷的特征之一是内耳听力细胞的逐渐退化和死亡，研究人员使用电子显微镜对这些重要细胞的结构进行了观察。正如预期，在未治疗的贝多芬小鼠耳内，听力细胞随着细胞结构的损伤而逐渐死亡。而在接受治疗的贝多芬小鼠和健康小鼠耳内，都保留有正常数量的听力细胞，细胞结构完整或近乎完整。

在最后一项试验中，科学家们在携带贝多芬突变的人类细胞中测试治疗效果。DNA 分析表明，这一基因疗法只对发生突变的 Tmc1 基因进行了基因剪切，没有影响正常基因。

由于这项技术能够识别单个碱基的突变，该方法也有望于治疗同样由单个碱基突变引发的其他 15 种遗传性耳聋。

除此之外，研究团队还提到，这项技术还可以应用于其他由单个碱基突变引发的显性遗传病。为验证该假设，科研人员搜索了联邦 ClinVar 数据库——一个包含了与所有已知人类疾病相关的基因突变的美国国家数据库。分析表明，基于该技术的特异性，它能够正确地识别出 3759 种缺陷性基因突变，占人类显性突变数量的五分之一。

该研究的另一位负责人、哈佛医学院教授、麻省儿童医院神经病学家 Jeffrey Holt 补充说：“我们相信，我们的研究敲开了通向超级靶向疗法方向的大门，这种方法可治疗大量由单基因缺陷引发的遗传病。这是真正意义上的精准医疗。当然，这只是漫长探索旅程的第一步。但实验结果已经证实了我们的理论：这种高度特异性、高度靶向性的治疗方法能够通过进一步发展，选择性地沉默携带单碱基突变的基因，有望于治疗很多其他形式的人类疾病。”

该研究的共同研究人员包括: Carl Nist-Lund, Bifeng Pan, Yukako Asai, K. Domenica Karavitaki, Benjamin Kleinstiver, Sara Garcia, Mikolaj Zaborowski, Paola Solanes, Sofia Spataro, Bernard Schneider, Keith Joung 和 Gwenaelle Geleoc。