Nature丨陈志坚组解开困扰学界多年的关于NLRP3炎症小体 ...

两个小胖猪遗

责编丨迦溆




图为获得“生命科学突破奖”的陈志坚教授

2018年11月28日，前不久刚获得“生命科学突破奖”（热烈祝贺陈志坚、庄小威获得『生命科学突破奖』；科学“奥斯卡”『视界』，2019年“科学突破奖”之庄小威、陈志坚）的美国德克萨斯大学西南医学中心的陈志坚（Zhijian 'James' Chen）研究组在Nature上在线发表了题为PtdIns4P on dispersed trans-Golgi network mediates NLRP3 inflammasome activation的重量级研究文章（Article），解开了一个困扰学术界多年的谜题： NLRP3炎症小体是如何凭借一己之力识别大量高度多样性的激动剂，从而对病原体入侵、环境压力和组织病变做出反应的。





文章发现NLRP3炎症小体（inflammasome）的多种差异极大的激动剂均能引起细胞内的高尔基体反面网络结构（trans-Golgi network， TGN）解体成分散的特殊结构（dTGN）。dTGN形成以后，其膜上富集的负电磷脂PtdIns4P会招募原本处于细胞质基质内的NLRP3到dTGN上组装成激活的炎症小体。同时，这篇文章也第一次揭示了高尔基体反面网络结构（TGN）在信号通路中的重要作用，展现出这个细胞器不为人知的新一面。

炎症反应（inflammation）是细胞对微生物感染、外界刺激以及自身组织损伤做出的复杂生物学反应，包括疼痛，发热，发红，发肿以及组织功能受损等一系列症状【1】。炎症反应就像一柄双刃剑，既能保护机体也能对机体造成不可磨灭的伤害。这是因为一方面，炎症反应能够及时清理病原体和受损的细胞并引发愈合过程；另一方面，不受控制的炎症反应会引起组织和细胞的各种病变，诱发自体免疫性疾病（autoimmune diseases）及其他炎症性疾病，甚至导致机体死亡。作为炎症反应的重要组成部分，炎症小体在2002年被Jürg Tschopp实验组发现【2】以后就一直是免疫和炎症疾病领域的重点研究对象。炎症小体是一个蛋白复合物，主要包含受体蛋白（receptor）、接头蛋白（adaptor）ASC以及下游的胱天蛋白酶caspase-1（图1）。受体蛋白被激动剂激活后，会随之吸引ASC和caspase-1组装成直径可达微米级的炎症小体，从而诱导caspase-1自切割并活化。活性caspase-1一方面促进包括白细胞介素-1β（IL-1β）和-18（IL-18）在内的多种促炎性细胞因子的成熟和分泌，另一方面引发能够清理病原体和受损细胞的细胞焦亡（Pyroptosis）。




图1：来自参考文献【3】。炎性小体主要由受体蛋白（receptor）、接头蛋白（adaptor）ASC以及下游的胱天蛋白酶caspase-1组成。其中受体蛋白包含来自NLR家族的NLRP1， NLRP3，NLRC4等成员以及来自HIN200家族的AIM2。大部分受体蛋白在激活后能够通过自身的PYRIN（PYD）结构域与接头蛋白ASC的PYD结构域结合从而激活ASC，ASC随即通过自身的CARD结构域与下游caspase-1的CARD结构域结合从而引发caspase-1的自切割与成熟化。

根据受体蛋白的不同，炎症小体主要有NLRP3、NLRC4、AIM2、NLRP1等几种。跟其他模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）类似，绝大部分炎症小体的受体蛋白也是通过直接或间接结合一种（或少数几种）特异的激动剂被激活的。但NLRP3是个例外 - 它能够对数量繁多并且在来源、化学组成、结构性质上都毫无关联的激动剂做出反应（图2）。NLRP3激动剂不仅包括来自入侵病原体的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）（例如细菌RNA、细菌多肽类抗生素和流感病毒离子通道蛋白），还有受损机体自身产生的损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）（例如ATP），以及多种跟疾病密切关联的分子（例如阿尔茨海默病中的β-淀粉样蛋白（amyloid β）以及动脉粥样硬化中的胆固醇结晶（cholesterol crystal））等等。因此，NLRP3炎症小体在病原体感染，自身炎症反应，神经退行性疾病，癌症，2型糖尿病等多种人类疾病中都发挥着举足轻重的作用【3】。




图2：来自参考文献【3】。大部分炎症小体只会被一种或少数几种高度特异的激动剂激活（例如AIM2只会被来自DNA病毒或细菌的DNA激活）。但是NLRP3与众不同 ：它能够对来源丰富并且在结构和化学性质上没有关联的多种激动剂做出反应，因此它的功能范围也是所有炎症小体中最为广泛的。

由于这些激动剂的高度差异性，以及没有证据表明NLRP3能够直接结合这些激动剂，研究者们一直认为NLRP3 激动剂是通过激发一个共同细胞信号来间接激活NLRP3炎症小体的。但是这个细胞信号究竟是什么，多年来一直没有一个确定的答案【4】。这可能是因为对NLRP3激活机制的研究主要有三个方面的障碍。一方面，接头蛋白ASC的类朊毒体（prion-like）特质使得炎症小体的组装极其迅速【5, 6】，阻碍了对上游受体NLRP3刚被激活后的变化的观察；另一方面，caspase-1的激活引发细胞焦亡，干扰了对细胞内蛋白和细胞器的实时观测；最后，由于缺乏检测NLRP3活性的生化方法，以往的研究者们无法区分有活性和无活性的NLRP3在细胞内的行为差异。

在最新发表的Nature文章中，研究人员成功地建立了一个能够有效检测NLRP3活性的体外生化实验，为突破上面提到的三重障碍打下了基础。文章创新性地把NLRP3通路一分为二： “上游”（activator）细胞株只表达NLRP3，“下游”（recipient）细胞株只表达ASC和caspase-1；把激动剂刺激过的上游细胞株细胞提取物与经过半通透处理的下游细胞株细胞混合后，可以通过观察caspase-1自切割来检测NLRP3的活性（图3，左栏）。这个生化试验的优点在于研究者可以把上游细胞株的细胞提取物通过生化方法一步步进行分离和提纯，从而确定激活与未激活的NLRP3之间的差异。通过这个手段，文章发现NLRP3的活性富集在密度较轻的膜结构（light membrane）上。同时，通过对上游细胞株的显微镜观测，研究人员发现原本只存在于细胞质基质的NLRP3在激动剂刺激后会聚集到大量囊泡状（vesicle-like）结构的外围形成聚合物（aggregates）（图3，右栏）。对这些NLRP3聚合物的分离和活性检测证实了它们正是被激活的NLRP3。



      


图3：来自Nature文章。左栏：检测NLRP3活性的生化试验。NLRP3通路被一分为二，受体NLRP3只表达在上游（activator）细胞株，而ASC和caspase-1只表达在下游（recipient）细胞株。经过激动剂处理后，上游细胞株的细胞提取物（含有已激活的NLRP3）与经过半通透处理的下游细胞株一起孵育，一段时间后可以检测到caspase-1的自切割激活。右栏：原本处于细胞质基质内的NLRP3在激动剂（nigericin，Nig）处理后会被招募到囊泡状结构上形成聚合物。这里用的是只表达NLRP3的上游细胞株，排除了下游类朊毒体（prion-like）蛋白ASC以及细胞焦亡的干扰。


这些囊泡状结构是什么呢？通过对细胞内多个细胞结构的显微镜观测，研究人员惊讶地发现这些囊泡状结构来自解体的高尔基体反面网络结构（TGN）（图4，左栏）。与此形成鲜明对比的是高尔基体顺面/中面结构（cis/medial-Golgi）以及细胞内其他细胞器（内质网、线粒体等）并没有显著变化，而且细胞健康状态良好。同时，其他类型的炎症小体（例如AIM2）激动剂并不会引起类似的TGN解体。研究人员把这种新发现的NLRP3激动剂诱导形成的TGN特殊形态命名为dispersed TGN （dTGN）。在电镜下，dTGN结构呈直径0.5至2微米的单膜囊泡状结构（图4，右栏）。进一步的实验发现不同种类的NLRP3激动剂均会诱导dTGN的形成以及NLRP3在dTGN上的聚集，包括原代培养巨噬细胞（macrophage）中的内源NLRP3。这些结果表明TGN解体和NLRP3到dTGN上的转运是位于多样化NLRP3激动剂下游的共同细胞信号。






图4：来自Nature文章。左栏：NLRP3激动剂的刺激导致高尔基体反面网络结构（TGN，由蛋白TGN38标记）解体为多个囊泡状结构。NLRP3由细胞质基质转运到这些囊泡状结构（dTGN）上并形成聚合物。右栏：电镜下可以看到NLRP3激动剂诱导的dTGN呈现为大量直径为0.5至2微米的单膜囊泡状结构。

为了验证这一共同细胞信号是否为NLRP3炎症小体被激活的关键，研究人员决定分别从NLRP3和dTGN两方面入手探索NLRP3转运到dTGN的具体分子机制。经过对NLRP3一系列缺失变异体（truncated mutants）的检测，文章发现NLRP3的PYRIN结构域和NACHT结构域之间存在一个高度保守的正电区域，其中一个仅含4个氨基酸的结构模体（命名为KKKK模体）在所有已知的NLRP3基因中都含有至少3个正电氨基酸（图5，左栏）。对KKKK模体的突变表明这一保守正电序列对于NLRP3到dTGN的转运以及NLRP3炎症小体的激活都是必需的（图5，右栏）。这些结果进一步证实了dTGN转运在NLRP3通路中的重要作用。






图5：来自Nature文章。左栏：NLRP3的PYRIN结构域和NACHT结构域之间有一个高度保守的正电区域，其中由4个氨基酸组成的KKKK模体在所有已知的NLRP3基因中都含有至少3个正电氨基酸。右栏：当KKKK模体被完全突变为丙氨酸（Ala）时，NLRP3炎症小体对激动剂（nigericin，Nig或gramicidin，Gra）不再有反应；当KKKK模体被突变为同样带正电的精氨酸（Lys）时，NLRP3炎症小体能被有效激活。这说明KKKK模体是通过本身的正电对NLRP3激活起作用的。

NLRP3为什么需要正电序列转运到dTGN上呢？文章发现纯化后的NLRP3 KKKK模体可以通过自身的正电荷结合负电磷脂。为了检测dTGN上的磷脂是否可以吸引NLRP3的聚集，研究人员把磷脂磷酸酶（phospholipid phosphatases）引导到dTGN上，然后观测其对NLRP3转运以及激活的影响。在多种被检测的磷脂磷酸酶中，只有水解PtdIns4P的磷酸酶会显著降低NLRP3的dTGN转运（图6，左栏）以及活性。为了进一步证明NLRP3正电序列和PtdIns4P之间的结合确实是激活NLRP3炎症小体的关键，研究者把NLRP3的KKKK 模体替换成了来自OSBP蛋白的PH结构域（一个经典的能够结合PtdIns4P的结构域 ）。结果表明OSBP-PH能够完全替代KKKK 模体引导NLRP3聚集到dTGN以及激活炎症小体的作用，而且更重要的是，这一替代是建立在OSBP-PH结合PtdIns4P能力的基础上的（图6，右栏）。这些结果再次有力地证明了dTGN通过磷脂PtdIns4P诱导NLRP3的转运和聚集从而激活炎症小体。






图6：来自Nature文章。左栏：水解PtdIns4P的磷酸酶Sac1在被引导到TGN之后，会显著降低NLRP3到dTGN的转运。相反的，没有磷酸酶活性的Sac1（CS变异体）则不会影响dTGN对NLRP3的招募。右栏：NLRP3的KKKK模体是炎症小体激活所必需的，而且可以被同样能够结合PtdIns4P的OSBP-PH结构域替代。2RE：失去结合PtdIns4P能力的OSBP-PH变异体无法替代KKKK模体在NLRP3炎症小体激活中的作用。

在细胞株和体外生化实验中揭示了NLRP3激活的分子机制以后，文章进一步在原代培养的巨噬细胞中详细验证了这一模型的通用性，包括最近刚发现的不依赖钾离子外流（K+ efflux-independent）的NLRP3激动剂【7】。

综上，通过对生化、细胞生物学、免疫学和分子生物学手段的综合运用，这篇文章首次揭示了在来源、化学组成和结构特质上千差万别的NLRP3激动剂均可引起一个共同的细胞信号 - 高尔基体反面网络结构（TGN）的特异性解体（图7）。在以往的研究中，人们对TGN的认识往往局限在它作为高尔基体（Golgi apparatus）的一个固有组成部分在蛋白质和脂质运输中的中转站角色。现在，本文第一次揭示了TGN这个细胞器在免疫和炎症信号通路中独特而重要的功能。最重要的是，dTGN的形成提供了一种新型的“非我”（'alter-self'）警告信号，使得NLRP3炎症小体能够通过转运到dTGN上聚合激活而对包括病原体入侵、组织病变以及外界环境压力在内的多种信号做出反应，大有“一夫当关，万夫莫开”之势。

虽然激动剂如何诱导dTGN结构形成还需要更多的研究，但是这一重大发现毫无疑问解开了免疫和炎症反应领域的一个多年谜题，并且将会为病原微生物感染、自身免疫疾病、阿尔茨海默病、癌症等多种疾病的治疗和预防提供新的靶点。




图7：来自Nature文章。NLRP3炎症小体的激活机制。中栏：在未激活情况下，NLRP3位于细胞质基质中，高尔基体反面网络结构（TGN，红色结构）与高尔基体顺面/中面结构（cis/medial-Golgi，紫色）紧密相连。左栏和右栏：性质特异的NLRP3激活剂均会引起TGN解体为分散的dTGN结构，dTGN随即通过膜上的负电磷脂PtdIns4P结合NLRP3上的正电序列，从而招募NLRP3并激活炎症小体。

据悉，陈珏琪（Jueqi Chen）博士为本文的第一作者，陈志坚（Zhijian 'James' Chen）教授为本文的通讯作者。

参考文献

1.    Takeuchi, O. & Akira, S. Pattern recognition receptors and inflammation. Cell 140, 805-20 (2010).
2.    Martinon, F., Burns, K. & Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell 10, 417-26 (2002).
3.    Lamkanfi, M. & Dixit, V.M. Inflammasomes and their roles in health and disease. Annu Rev Cell Dev Biol 28, 137-61 (2012).
4.    He, Y., Hara, H. & Nunez, G. Mechanism and Regulation of NLRP3 Inflammasome Activation. Trends Biochem Sci 41, 1012-1021 (2016).
5.    Cai, X. et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell 156, 1207-1222 (2014).
6.    Lu, A. et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell 156, 1193-1206 (2014).
7.    Gross, C.J. et al. K+ Efflux-Independent NLRP3 Inflammasome Activation by Small Molecules Targeting Mitochondria. Immunity 45, 761-773 (2016).




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